En utvärdering av olika superupplösningsmikroskopimetoder
För konventionell ljusmikroskopi begränsar diffraktion av ljus bildupplösningen till cirka 250 nm. Idag kan superupplösningstekniker förbättra detta med mer än en faktor 10. Denna teknik uppnås huvudsakligen genom tre metoder: enkelmolekylslokaliseringsmikroskopi, inklusive fotokänslig lokaliseringsmikroskopi (PALM) och stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM); strukturerad belysningsmikroskopi (SIM); och stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi (STED). Hur man väljer superupplösningsteknik är vad alla bryr sig om. "Tyvärr finns det inga enkla principer för att bestämma vilken metod som ska användas", säger Mathew Stracy, postdoktor vid University of Oxford, Storbritannien. "Var och en har sina egna fördelar och nackdelar." Forskare funderar naturligtvis också på hur man väljer rätt metod för ett visst projekt. "I samband med bioavbildning inkluderar nyckelfaktorer att överväga: rumslig och tidsmässig upplösning, känslighet för fotoskador, märkningskapacitet, provtjocklek och bakgrundsfluorescens eller cellautolog fluorescens." Så fungerar det De olika superupplösningsmikroskopen fungerar på olika sätt. I fallet med PALM och STORM är endast en liten del av fluorescerande markörer exciterade eller fotoaktiverade vid ett givet ögonblick, vilket möjliggör deras oberoende lokalisering med hög precision. Att gå igenom denna process med alla fluorescerande etiketter resulterar i en komplett superupplöst bild.
Stefan Hell, en av vinnarna av 2014 års Nobelpris i kemi och chef för Max Planck Institute of Biophysical Chemistry, sa: "PALM/STORM-systemet är relativt lätt att installera, men det är svårt att tillämpa, eftersom det fluorescerande Gruppen måste ha fotoaktiveringsförmåga. Begränsningar Nackdelen är att de behöver detektera en enda fluorescerande molekyl i en cells sammanhang och är mindre tillförlitliga än STED." STED använder en laserpuls för att excitera fluoroforen och en ringformad laser för att släcka fluoroforen, vilket bara lämnar den mellanliggande nanometerstora fluorescensen för superupplösning. Genom att skanna hela provet skapas en bild. "Fördelen med STED är att det är en tryckknappsteknik," förklarade Hell. "Det fungerar som ett standard konfokalt fluorescensmikroskop." Den kan också avbilda levande celler med hjälp av fluoroforer som gröna eller gula fluorescerande proteiner och rhodamin-härledda färgämnen. Parametrisk jämförelse Även om alla superupplösningstekniker överträffar konventionell ljusmikroskopi när det gäller upplösning, skiljer de sig från varandra. SIM fördubblar ungefär upplösningen till cirka 100 nm. PALM och STORM kan lösa 15 nm mål. Enligt Hell ger STED en rumslig upplösning på 30 nm i levande celler och 15 nm i fixerade celler. När det gäller specifika applikationer måste vi också ta hänsyn till signal-brusförhållandet.
I vissa fall kan lägre upplösning men högre SNR resultera i en bättre bild än den motsatta (högre upplösning men lägre SNR). Hastigheten för bildinsamling är också mycket viktig, särskilt för levande celler. "Alla superupplösningstekniker är långsammare än konventionella fluorescenstekniker," sa Stracy. "PALM/STORM är den långsammaste, den behöver tiotusentals bildrutor för att få en enda bild, SIM behöver dussintals bildrutor och STED är en skanningsteknik, så inhämtningshastigheten beror på storleken på synfältet." Förutom levande celler eller fasta avbildningsceller vill vissa forskare också förstå hur föremål rör sig. Stracy är intresserad av att förstå dynamiken hos biologiska system i levande celler, inte bara statiska bilder. Han kombinerar PALM med spårning av en enda partikel för att analysera dynamiken i levande celler. På så sätt kan han direkt spåra markörmolekylerna när de utför sina funktioner. Han menar dock att SIM inte lämpar sig för att studera dessa dynamiska processer på molekylär nivå, men på grund av dess snabba upptagningshastighet är det särskilt lämpligt för att observera dynamiken i större strukturer, såsom hela kromosomer.
De senaste resultaten Under 2017 rapporterade Hells team MINFLUX superupplösningsmikroskop i Science. Enligt Hell uppnår denna superupplösningsmetod en rumslig upplösning på 1 nm för första gången. Dessutom kan den spåra enskilda molekyler i levande celler minst 100 gånger snabbare än andra metoder. Andra forskare talade också mycket om MINFLUX-mikroskopet. "Nya applikationer och tillvägagångssätt utvecklas ständigt, men två framsteg sticker ut för mig," sa Shechtman. En är MINFLUX. "Den använder ett genialiskt tillvägagångssätt för att få mycket exakt molekylär positionering." När det gäller den andra spännande utvecklingen nämnde Shechtman WE Moerner och hans kollegor vid Stanford University. Moerner var också mottagare av 2014 års Nobelpris i kemi. En av vinnarna. För att ta itu med begränsningen av bildupplösning som orsakas av anisotropisk spridning av fluorescerande enstaka molekyler, använde forskarna olika excitationspolarisationer för att bestämma orienteringen och positionen för molekylerna. Dessutom har de utvecklat ömtåliga pupillytor. Dessa tekniker förbättrar förmågan att lokalisera strukturer. Om fluorescerande etiketter I många superupplösningstillämpningar spelar etiketter verkligen roll. Det finns också några företag som tillhandahåller relaterade produkter.
Till exempel har tyska Miltenyi slagit sig ihop med Abberior, ett företag som grundats av Stefan Hell, för att tillhandahålla anpassade antikroppskonjugeringstjänster för mikroskopfärger med superupplösning. Ett antal andra företag erbjuder också matchande markörer. "Våra Nano-Boosters är väldigt små, bara 1,5 kDa, och mycket specifika", säger Christoph Eckert, marknadsansvarig på ChromoTek. Dessa proteiner binder gröna och röda fluorescerande proteiner (GFP och RFP). De härrör från alpackaantikroppsfragment, kända som VHH eller nanobodies, med utmärkta bindningsegenskaper och stabil kvalitet utan batch-till-batch-variation. Dessa markörer är lämpliga för olika superupplösningstekniker inklusive SIM, PALM, STORM och STED. Ai-Hui Tang, biträdande professor vid University of Maryland School of Medicine, och kollegor använde ChromoTeks GFP-Booster och STORM för att utforska informationsspridning i nervsystemet. De hittade molekylära nanokluster, kallade nanokolonner, i presynaptiska och postsynaptiska neuroner. Forskarna tror att denna struktur visar att det centrala nervsystemet använder enkla principer för att upprätthålla och reglera synaptisk effektivitet. Olika versioner av superupplösningsbilder och ett växande antal metoder tar forskarna ännu djupare in i biologiska mysterier. Genom att bryta diffraktionsgränsen för synligt ljus kan biologer till och med "nära övervaka" cellers handlingar.
