Tillämpning av Fluorescens Total Intern Reflection Fluorescensmikroskopi
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), total internreflektionsfluorescensmikroskop, när ljus kommer in i ett medium med ett lägre brytningsindex från ett medium med ett högt brytningsindex, om infallsvinkeln är tillräckligt stor, reflekteras allt ljus utan brytning, men i Gränssnittet mellan de två medierna producerar evanescenta vågor som kan excitera fluorescensen inom 100 nm nära gränssnittet för att förverkliga observationen av objektytan. Excitationsljuset kan skickas genom illuminatorn i ett konventionellt fluorescensmikroskop eller en speciell illuminator, och laserns infallsvinkel kan kontrolleras. Den momentana fältexciteringsmetoden används för att förhindra att excitationsljuset kommer in i detektorn. Excitationsljuset vid gränssnittet mellan glas och vatten producerar en fullständig intern implementerad genom reflektion. På grund av den exponentiella dämpningen av excitationsljuset kommer endast provområdet mycket nära den totala reflektionsytan att producera fluorescensreflektion, vilket avsevärt minskar störningen av bakgrundsljusbrus till observationsmålet, så denna teknik används ofta i den dynamiska observationen av cellytämnen.
Schematiskt diagram över total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM)
①Prov ②Evanescent vågområde ③Täckglas ④Oljenedsänkning ⑤Mål ⑥Emissionsstråle (signal) ⑦Excitationsstråle
För att uppnå total intern reflektion krävs en stor infallsvinkel, till exempel är infallsvinkeln vid glas-vattengränsytan större än 61 grader. Detta kan uppnås med ett prisma, som kallas prismabaserad TIRFM, eller med ett objektiv med en hög numerisk bländare, som kallas TIRFM av objektivtyp. De nuvarande kommersialiserade totala interna reflektionsfluorescensmikroskopen är i allmänhet av typen objektivlins, med hög hastighet och hög precision.
Total intern reflektionsfluorescensmikroskopi används i stor utsträckning inom vissa biologiska områden eftersom den kan realisera fluorescensobservation i ett mycket tunt område (mindre än 100 nm) på ytan av föremål. Till exempel följande applikationer:
Observation av cellytbilder: cellmembranets ytstruktur, cellytans kontakt, membranytdynamik/proteinlokalisering.
Observation och manipulation av en molekyl: myosin, aktin och Cy3-märkt ATP.
Cellmembranets ytrörelse: såsom vesikeluppslukning, vesikelutandning och exokrin vesikel. de
Observation av kalciumgnistbildningsfenomen i cellmembran, jonkanalövervakning.
Molekylär motorisk forskning: rotationsmotorer, cytoskelettproteiner, polymerer, G-proteiner, ringproteiner, nukleotidmotorer.
Förutom biologiområdet har det också goda tillämpningar inom kemiområdet för observation av kemiska molekylära strukturer.
