Jämförelse mellan konfokalmikroskop och vanligt optiskt mikroskop
Allmänt optiskt mikroskop
Det allmänna biologiska mikroskopet består av tre delar, nämligen: ① belysningssystem, inklusive ljuskälla och kondensor; ② Optiskt förstärkningssystem, som består av objektivlins och okular, är huvuddelen av mikroskopet. För att eliminera sfärisk aberration och kromatisk aberration är både okularet och objektivlinsen sammansatta av komplexa linsgrupper; (3) mekanisk anordning, som används för att fixera material och bekväm observation.
Huruvida mikroskopbilden är klar eller inte beror inte bara på förstoringen utan också på mikroskopets upplösning. Upplösning hänvisar till förmågan hos mikroskopet (eller platsen där mänskliga ögon är 25 cm från målet) att särskilja det lilla intervallet för objektet zui. Upplösningen beror på ljusets våglängd, bländarförhållandet och mediets brytningsindex, vilket uttrycks med formeln:
R=0.61λ /N．A. N．A．＝ｎsin /2
Där: n= brytningsindex för medium;=spegelvinkel (provets öppningsvinkel mot objektivets bländare) och NA= numerisk bländare. Spegelvinkeln är alltid mindre än 180? Därför måste zui-värdet för sina/2 vara mindre än 1.
Brytningsindexet för glaset som används för att tillverka optiska linser är 1,65 ~ 1,78, och brytningsindexet för mediet som används är närmare glasets, desto bättre. För den torra objektivlinsen är mediet luft, och bländarförhållandet är i allmänhet 0.05 ~ 0,95; Oljelinsen använder doftande asfalt som medium, och linsens öppningshastighet kan vara nära 1,5.
Våglängden för vanligt ljus är 400~700nm, så mikroskopets upplösning är inte mindre än 0,2μm, och upplösningen för det mänskliga ögat är 0,2mm, så den stora förstoringen av zui designad av allmänt mikroskop är vanligtvis 1000X x.
Varför behöver du ett konfokalmikroskop?
1. Det optiska mikroskopet har fulländats genom ansträngningar och förbättringar från våra stora föregångare. Faktum är att vanliga mikroskop kan ge oss vackra mikroskopiska bilder enkelt och snabbt. Men en händelse som förde revolutionerande innovation till denna nästan perfekta mikroskopvärld inträffade, vilket är uppfinningen av "laser scanning confocal microscope". Detta nya mikroskop kännetecknas av att använda ett optiskt system som endast extraherar bildinformationen på planet där fokus är koncentrerat, och återställer den erhållna informationen i bildminnet samtidigt som fokus ändras, så att en levande bild med fullständig tredimensionell information kan erhållas. Med denna metod kan information om ytformen som inte kan bekräftas med vanliga mikroskop enkelt erhållas. För vanliga optiska mikroskop är dessutom "förbättring av upplösningen" och "fördjupning av fokusdjupet" motsägelsefulla förhållanden, speciellt vid hög förstoring, men för konfokala mikroskop är detta problem löst.
2. Fördelar med konfokala optiska system
Konfokalt optiskt system belyser provpunkten, och det reflekterade ljuset tas också emot av punktreceptorer. När provet placeras i fokusläget kan nästan allt reflekterat ljus nå fotoreceptorn, men när provet avviker från fokus kan det reflekterade ljuset inte nå fotoreceptorn. Det vill säga, i det konfokala optiska systemet kommer endast den bild som sammanfaller med fokus att matas ut, och faculan och det värdelösa spridda ljuset kommer att avskärmas.
3. Varför använda laser?
I det konfokala optiska systemet belyses provet och det reflekterade ljuset tas också emot av en punktfotoreceptor. Därför blir punktljuskälla nödvändig. Laser tillhör en mycket punktljuskälla. I de flesta fall använder ljuskällan för konfokalmikroskop laserljuskälla. Dessutom är egenskaperna hos laser, såsom monokromaticitet, riktningsförmåga och utmärkt strålform, också viktiga skäl för dess breda användning.
4. Observation i realtid baserad på höghastighetsskanning blir möjlig.
I laserskanningen används den akustiska optiska deflektorn (AO prime element) i horisontell riktning och Servo Galvano-spegeln används i vertikal riktning. Eftersom det inte finns någon mekanisk vibrationsdel i den akustiska optiska avböjningsenheten kan den skanna med hög hastighet och det är möjligt att observera i realtid på övervakningsskärmen. Den här kamerans höga hastighet är ett mycket viktigt projekt som direkt påverkar fokuseringshastigheten och positionsinhämtningen.
5. Samband mellan fokusposition och ljusstyrka
I det konfokala optiska systemet, när provet är korrekt placerat i fokuspositionen, är ljusstyrkan stor, och före och efter det kommer dess ljusstyrka att sjunka kraftigt (heldragen linje i figur 4). Denna känsliga selektivitet hos fokalplanet är också principen för att mäta höjdriktningen för konfokalmikroskop och utöka bränndjupet. Däremot har det vanliga optiska mikroskopet ingen tydlig ljusstyrkeförändring före och efter fokuspositionen (prickad linje i figur 4).
6. Hög kontrast och hög upplösning
I ett allmänt optiskt mikroskop kommer det reflekterade ljuset som avviker från fokus att störa, och det kommer att överlappa med fokusavbildningsdelen, vilket minskar bildkontrasten. Däremot, i det konfokala optiska systemet, avlägsnas det spridda ljuset utanför fokus och det spridda ljuset inuti objektivlinsen nästan helt, så en bild med mycket hög kontrast kan erhållas. Dessutom, eftersom ljuset passerar genom objektivlinsen två gånger, skärps punktbilden först, och upplösningen i mikroskopet förbättras också.
7. Optisk lokaliseringsfunktion
I det konfokala optiska systemet är det reflekterade ljuset från den andra delen än brännpunkten avskärmad av mikroporer. Därför, när man observerar ett tredimensionellt prov, bildas en bild liknande den som bildas efter att man skär provet med fokus (Figur 5). Denna effekt kallas optisk lokalisering, som tillhör en av specialiteterna för konfokala optiska system.
8. Fokusera rörlig minnesfunktion
Det så kallade reflekterade ljuset utanför fokuset är avskärmat av mikroporerna. Å andra sidan kan det anses att alla punkter på bilden som bildas av det konfokala optiska systemet sammanfaller med fokus. Därför, om det tredimensionella provet flyttas längs Z-axelns (optiska axel) riktning, kommer bilden att ackumuleras och lagras i minnet, och zui kommer så småningom att få bilden som bildas av sammanträffandet av hela provet och fokus . På detta sätt kallas funktionen för oändligt fokuseringsdjup för mobil minnesfunktion.
9. Funktion för mätning av ytform
I fokusrörelsefunktionen kan provets ytform mätas på ett beröringsfritt sätt genom att lägga till en höjdregistreringsslinga. Baserat på denna funktion är det möjligt att registrera Z-axelns koordinater som bildas av det stora ljusstyrkan för zui i varje pixel, och baserat på denna information kan informationen relaterad till provets ytform erhållas.
10. Högprecisionsfunktion för mätning av mikrostorlek
Den ljusmottagande enheten använder en endimensionell CCD-avbildningssensor, så att den inte kan påverkas av skanningslutningen på skanningsenheten, så att högprecisionsmätning kan slutföras. Dessutom, eftersom funktionen för att flytta fokusminnet med justerbart fokusdjup används samtidigt, kan mätfelet som orsakas av fokusförskjutning elimineras.
11. Tredimensionell bildanalys
Med hjälp av ytformmätningsfunktionen kan den tredimensionella bilden av provytan enkelt göras. Inte bara det, utan också många typer av analyser kan utföras, såsom: ytråhetsmätning, area, volym, ytarea, cirkuläritet, radie, längd på zui, omkrets, tyngdpunkt, tomografisk bild, FFT-transform, linje breddmått och så vidare.
Konfokalt lasermikroskop kan användas inte bara för att observera cellmorfologi, utan också för kvantitativ analys av biokemiska komponenter i celler, optisk densitetsstatistik och cellmorfologimätning.
