Skillnaden mellan ett fluorescensmikroskop och ett vanligt mikroskop
Jag försökte nyligen göra några frysta delar av möss. Därefter kommer jag att använda ett fluorescensmikroskop för att se om viruset jag injicerade finns i det hjärnområde jag vill ha. Några grundläggande principer för fluorescensmikroskopi behöver läras kort, och jag kommer att dela dem här.
Fluorescensmikroskop använder ultraviolett ljus som en ljuskälla för att belysa föremålet som inspekteras, vilket får föremålet att avge ljus och sedan observera föremålet under mikroskopet. Det används främst för immunfluorescensceller. Den består huvudsakligen av en ljuskälla, ett filterplattesystem och ett optiskt system. Den fluorescerande bilden av provet observeras genom förstoringen av okularet och objektivlinsen. Låt oss ta en titt på skillnaden mellan ett fluorescensmikroskop och ett vanligt optiskt mikroskop.
1. Titta på belysningsmetoden
Belysningsmetoden för fluorescensmikroskop är i allmänhet epi-illuminering, vilket innebär att ljuskällan placeras på testprovet genom objektivlinsen.
2. Titta på upplösningen
Fluorescensmikroskop använder ultraviolett ljus som ljuskälla, som har en kortare våglängd men högre upplösning än vanliga optiska mikroskop.
3. Skillnader i filter
Fluorescensmikroskop använder två speciella filter, ett som används framför ljuskällan för att filtrera bort synligt ljus och ett som används mellan objektivlinsen och okularet för att filtrera bort ultravioletta strålar, vilket kan skydda mänskliga ögon.
Fluorescensmikroskop är också en typ av optiskt mikroskop. Den främsta anledningen är att våglängden som exciteras av fluorescensmikroskop är kort, så detta leder till skillnaden i struktur och användning mellan fluorescensmikroskop och vanligt mikroskop. De flesta fluorescensmikroskop har god funktion för att fånga svagt ljus. , så dess avbildningsförmåga är också bra under extremt svag fluorescens. Tillsammans med den kontinuerliga förbättringen av fluorescensmikroskop de senaste åren har bruset också minskat kraftigt. Därför används fler och fler fluorescensmikroskop.
Kunskap om två-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för två-fotonexcitation är: under villkor med hög fotondensitet kan fluorescerande molekyler absorbera två långvågiga fotoner samtidigt, och efter en kort livslängd för så kallat exciterat tillstånd, emittera en foton med kortare våglängd . Effekten är densamma som att använda en foton med en våglängd som är halva den långa våglängden för att excitera fluorescerande molekyler. Två-fotonexcitation kräver en hög fotondensitet. För att inte skada celler använder tvåfotonmikroskop högenergilägeslåsta pulslasrar. Denna laser avger laserljus med hög toppenergi och låg medelenergi, med en pulsbredd på endast 100 femtosekunder och en frekvens på 80 till 100 MHz. När man använder en objektivlins med hög numerisk bländare för att fokusera fotonerna i den pulsade lasern, är fotondensiteten i fokus för objektivlinsen högst. Två-foton-excitation sker endast i fokus på objektivlinsen, så två-fotonmikroskopet kräver inte ett konfokalt nålhål, vilket förbättrar effektiviteten för fluorescensdetektering.
I det allmänna fluorescensfenomenet, på grund av den låga fotondensiteten hos excitationsljuset, kan en fluorescerande molekyl endast absorbera en foton samtidigt och sedan avge en fluorescensfoton genom en strålningsövergång. Detta är enkelfotonfluorescens. För fluorescensexcitationsprocessen med laser som ljuskälla kan tvåfoton eller till och med multifotonfluorescensfenomen förekomma. I det här fallet är intensiteten hos den använda excitationsljuskällan hög, och fotondensiteten uppfyller kravet på att de fluorescerande molekylerna ska absorbera två fotoner samtidigt. I processen att använda vanliga lasrar som excitationsljuskällor är fotondensiteten fortfarande inte tillräcklig för att producera tvåfotonabsorption. Femtosekundspulslasrar används vanligtvis, och deras momentana effekt kan nå megawattnivån. Därför är våglängden för två-fotonfluorescens kortare än våglängden för excitationsljuset, vilket är ekvivalent med effekten som produceras av halv-excitationsvåglängdsexcitation.
