Skillnaden mellan fluorescensmikroskop och normalt mikroskop
1. Titta på belysningsmetoden
Belysningsmetoden för fluorescensmikroskop är i allmänhet epi-typ, det vill säga ljuskällan placeras på testprovet genom objektivlinsen.
2. Titta på upplösningen
Fluorescensmikroskop använder ultraviolett ljus som ljuskälla, med en relativt kort våglängd, men upplösningen är högre än för vanliga optiska mikroskop.
3, skillnaden i filtret
Fluorescensmikroskop använder två speciella filter, som används framför ljuskällan för att filtrera bort synligt ljus, och används mellan objektivlinsen och okularet för att filtrera bort ultraviolett ljus, vilket kan skydda mänskliga ögon.
Fluorescensmikroskop är också en typ av optiskt mikroskop, främst för att våglängden som exciteras av fluorescensmikroskopet är kort, så detta leder till skillnaden i strukturen och användningen av fluorescensmikroskopet och det vanliga mikroskopet. De flesta av fluorescensmikroskopen har en bra funktion att fånga svagt ljus. , så under extremt svag fluorescens är dess bildförmåga också bra. Tillsammans med den kontinuerliga förbättringen av fluorescensmikroskopi de senaste åren har bruset också minskat kraftigt. Därför används fler och fler fluorescensmikroskop.
Kunskaper om två-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för tvåfotonexcitation är: vid hög fotondensitet kan fluorescerande molekyler absorbera två långvågiga fotoner samtidigt, och efter en mycket kort livslängd för så kallat exciterat tillstånd, emittera en kortvågig foton ; effekten är densamma som att använda en foton med en våglängd som är hälften av den långa våglängden för att excitera en fluorescerande molekyl. Tvåfotonexcitation kräver hög fotondensitet, och för att inte skada celler använder tvåfotonmikroskopi högenergilägeslåsta pulsade lasrar. Denna laser avger laserljus med hög toppenergi och låg medelenergi, med en pulsbredd på endast 100 femtosekunder och en frekvens på 80 till 100 MHz. När en objektivlins med hög numerisk bländare används för att fokusera fotonerna i den pulsade lasern, är fotondensiteten vid objektivlinsens brännpunkt högst, och exciteringen av två foton sker endast vid objektivlinsens brännpunkt, så tvåfotonmikroskopet behöver inte ett konfokalt nålhål, vilket förbättrar effektiviteten för fluorescensdetektion.
I det allmänna fluorescensfenomenet, på grund av den låga fotondensiteten hos excitationsljuset, kan en fluorescerande molekyl bara absorbera en foton samtidigt och sedan avge en fluorescerande foton genom strålningsövergången, vilket kallas enkelfotonfluorescens. För fluorescensexcitationsprocessen med laser som ljuskälla kan tvåfoton eller till och med multifotonfluorescensfenomen förekomma. Vid denna tidpunkt är intensiteten hos den använda excitationsljuskällan hög, och fotondensiteten uppfyller kravet att den fluorescerande molekylen absorberar två fotoner samtidigt. I processen att använda en allmän laser som excitationsljuskälla är fotondensiteten fortfarande inte tillräcklig för att producera tvåfotonabsorption. Vanligtvis används en femtosekundspulsad laser, och dess momentana effekt kan nå storleksordningen megawatt. Därför är våglängden för tvåfotonfluorescensen kortare än våglängden för excitationsljuset, vilket är ekvivalent med effekten som produceras av halvexcitationsvåglängdsexcitationen.
Två-foton fluorescensmikroskopi har många fördelar:
1) Ljus med lång våglängd påverkas mindre av spridning än ljus med kort våglängd och kan lätt penetrera provet;
2) De fluorescerande molekylerna utanför fokalplanet exciteras inte, så att mer excitationsljus kan nå fokalplanet, så att excitationsljuset kan penetrera djupare prover;
3) Långvågigt nära-infrarött ljus är mindre giftigt för celler än kortvågigt ljus;
4) Vid visning av prover med tvåfotonmikroskopi är fotoblekning och fototoxicitet endast närvarande i fokalplanet. Därför är tvåfotonmikroskopi mer lämplig för att titta på tjocka prover än enkelfotonmikroskopi, för att titta på levande celler eller för att utföra fotoblekningsexperiment med fixpunkt.
Kunskaper om konfokal fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för konfokal fluorescensmikroskopi: med hjälp av en punktljuskälla för att belysa provet bildas en liten ljusfläck med en väldefinierad kontur på fokalplanet. utgörs av stråldelaren. Stråldelaren skickar fluorescensen direkt till detektorn. Det finns ett nålhål framför ljuskällan och detektorn, respektive kallat belysningshålet och detektionshålet. De geometriska dimensionerna för de två är desamma, ungefär 100-200 nm; i förhållande till ljuspunkten på fokalplanet är de två konjugerade, det vill säga ljuspunkten passerar genom en serie linser och kan slutligen fokuseras på belysningsnålhålet och detektionsnålhålet samtidigt. På detta sätt kan ljuset från fokalplanet koncentreras inom detektionshålets räckvidd, medan det spridda ljuset ovanifrån eller under fokalplanet blockeras ut ur detektionshålet och inte kan avbildas. Provet skannas punkt för punkt med lasern, och fotomultiplikatorröret efter detektering av pinhole erhåller också den konfokala bilden av motsvarande ljus punkt för punkt, som omvandlas till en digital signal och överförs till datorn, och slutligen aggregeras på skärmen till en tydlig konfokal bild av hela fokalplanet. .
Varje fokalplansbild är faktiskt ett optiskt tvärsnitt av provet, och detta optiska tvärsnitt har alltid en viss tjocklek, även känt som en optisk skiva. Eftersom ljusintensiteten vid brännpunkten är mycket större än den vid icke-brännpunkten, och ljuset i icke-brännplanet filtreras bort av nålhålet, är skärpedjupet för det konfokala systemet ungefär noll, och scanning längs Z-axeln kan realisera optisk tomografi, vilket bildar observera en tvådimensionell optisk sektion vid den fokuserade platsen av provet. Genom att kombinera XY-planet (fokalplan) skanning med Z-axeln (optisk axel) skanning, genom att ackumulera tvådimensionella bilder av på varandra följande lager och bearbetning med speciell datormjukvara, kan en tredimensionell bild av provet erhållas.
Det vill säga, detektionsnålhålet och ljuskällans nålhål är alltid fokuserade på samma punkt, så att fluorescensen som exciteras utanför fokuseringsplanet inte kan komma in i detektionsnålhålet.
Det enkla uttrycket för arbetsprincipen för konfokal laser är att den använder en laser som ljuskälla, och på basis av traditionell fluorescensmikroskopavbildning är en laserskanningsanordning och en konjugatfokuseringsanordning ansluten, och den digitala bildinsamlingen och -bearbetningen systemet styrs av en dator.
