Skillnaden mellan vanligt mikroskop och fluorescensmikroskop
Fluorescensmikroskop använder ultraviolett ljus som en ljuskälla för att bestråla föremålet som ska inspekteras, så att föremålet avger ljus, och sedan observera föremålet under mikroskopet. Det används främst för immunfluorescensceller. Den består huvudsakligen av en ljuskälla, ett filterplattesystem och ett optiskt system för att observera den fluorescerande bilden av provet genom förstoringen av okularet och objektivlinsen. Låt oss ta en titt på skillnaden mellan detta fluorescensmikroskop och ett vanligt optiskt mikroskop.
1. När det gäller belysningsmetoder
Belysningsmetoden för fluorescensmikroskopet är i allmänhet episkopisk, det vill säga ljuskällan projiceras på testprovet genom objektivlinsen.
2. När det gäller upplösning
Fluorescensmikroskop använder ultraviolett ljus som ljuskälla. Våglängden är relativt kort, men upplösningen är högre än för vanliga optiska mikroskop.
3. Skillnaden i filtret
Fluorescensmikroskopet använder två speciella filter, som används framför ljuskällan för att filtrera bort synligt ljus, och som används mellan objektivlinsen och okularet för att filtrera bort ultraviolett ljus, vilket kan skydda mänskliga ögon.
Fluorescensmikroskop är också ett slags optiskt mikroskop, främst för att våglängden som exciteras av fluorescensmikroskop är kort, så detta leder till skillnaden i struktur och användning mellan fluorescensmikroskop och vanligt mikroskop. De flesta fluorescensmikroskop har en bra funktion att fånga svagt ljus, så under extremt svag fluorescens är dess bildförmåga också bra. Tillsammans med den kontinuerliga förbättringen av fluorescensmikroskop de senaste åren har bruset också minskat kraftigt. Därför används fler och fler fluorescensmikroskop.
Kunskap om två-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för tvåfotonexcitation är: vid hög fotondensitet kan fluorescerande molekyler absorbera två långvågiga fotoner samtidigt och emittera en kortare våglängdsfoton efter en kort period av så kallat exciterat tillståndslivslängd . ; effekten är densamma som att använda en foton vars våglängd är halva den långa våglängden för att excitera en fluorescerande molekyl. Två-fotonexcitation kräver en hög fotondensitet. För att inte skada celler använder tvåfotonmikroskopi högenergilägeslåsta pulsade lasrar. Lasern som sänds ut av denna laser har hög toppenergi och låg medelenergi, dess pulsbredd är bara 100 femtosekunder och dess frekvens kan nå 80 till 100 megahertz. När man använder en objektivlins med hög numerisk bländare för att fokusera fotonerna i den pulsade lasern, är fotondensiteten vid objektivlinsens brännpunkt högst, och tvåfotonexcitationen sker endast vid objektivlinsens brännpunkt, så två-fotonmikroskopet behöver inte ett konfokalt nålhål, vilket förbättrar effektiviteten för fluorescensdetektion.
I allmänna fluorescensfenomen, på grund av den låga fotondensiteten hos excitationsljuset, kan en fluorescerande molekyl bara absorbera en foton samtidigt och sedan avge en fluorescerande foton genom en strålningsövergång, vilket är enkelfotonfluorescens. För fluorescensexcitationsprocessen med laser som ljuskälla kan tvåfoton eller till och med multifotonfluorescens förekomma. Vid denna tidpunkt är intensiteten hos den använda excitationsljuskällan hög, och fotondensiteten uppfyller kraven för fluorescerande molekyler som absorberar två fotoner samtidigt. I processen att använda en allmän laser som excitationsljuskälla är fotondensiteten fortfarande inte tillräcklig för att producera tvåfotonabsorptionsfenomenet. Vanligtvis används en femtosekundspulsad laser, och dess momentana effekt kan nå storleksordningen megawatt. Därför är våglängden för två-fotonfluorescens kortare än våglängden för excitationsljus, vilket är ekvivalent med effekten som produceras av excitation vid halva excitationsvåglängden.
Två-foton fluorescensmikroskopi har många fördelar:
1) Ljus med lång våglängd påverkas mindre av spridning än ljus med kort våglängd och penetrerar lätt provet;
2) De fluorescerande molekylerna utanför fokalplanet exciteras inte, så att mer excitationsljus kan nå fokalplanet, så att excitationsljuset kan penetrera djupare prover;
3) Långvågigt nära-infrarött ljus är mindre giftigt för celler än kortvågigt ljus;
4) När man använder ett tvåfotonmikroskop för att observera prover förekommer fotoblekning och fototoxicitet endast i fokalplanet. Därför är tvåfotonmikroskopi mer lämplig än enkelfotonmikroskopi för att observera tjocka prover, för att observera levande celler eller för fläckfotoblekningsexperiment.
Kunskaper om konfokal fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för konfokal fluorescensmikroskopi: en punktljuskälla används för att bestråla provet och en väldefinierad liten ljusfläck bildas på fokalplanet. består av splitters. Stråldelaren skickar fluorescensen direkt till detektorn. Det finns ett nålhål framför ljuskällan och detektorn, respektive kallat belysningshålet och detektionshålet. Den geometriska storleken på de två är densamma, ungefär 100-200nm; i förhållande till ljuspunkten på fokalplanet är de två konjugerade, det vill säga ljuspunkten passerar genom en serie linser och kan slutligen fokuseras på belysningsnålhålet och detektionsnålhålet samtidigt. På detta sätt kan ljuset från fokalplanet konvergeras inom detektionshålets omfång, medan det spridda ljuset från ovan eller under fokalplanet blockeras utanför detektionshålet och inte kan avbildas. Lasern skannar provet punkt för punkt, och fotomultiplikatorröret efter detektering av pinhole erhåller också den konfokala bilden av motsvarande ljus punkt för punkt, som omvandlas till en digital signal och överförs till datorn och slutligen aggregeras till en klar konfokal bild av hela fokalplanet på skärmen.
Varje fokalplansbild är faktiskt ett optiskt tvärsnitt av provet. Detta optiska tvärsnitt har alltid en viss tjocklek, även känt som en optisk tunn sektion. Eftersom ljusintensiteten vid brännpunkten är mycket större än den vid icke-fokuspunkten, och ljuset i icke-fokalplanet filtreras av nålhålet, är skärpedjupet för det konfokala systemet ungefär noll, och scanning längs Z -axeln kan realisera optisk tomografi, som bildar en observera den tvådimensionella optiska sektionen på den fokuserade platsen av provet. Genom att kombinera XY-plan (fokalplan) skanning med Z-axel (optisk axel) skanning, kan den tredimensionella bilden av provet erhållas genom att ackumulera tvådimensionella bilder av kontinuerliga lager och bearbetas med speciell datorprogramvara.
Det vill säga, detektionsnålhålet och ljuskällans nålhål är alltid fokuserade på samma punkt, så att fluorescensen som exciteras utanför fokalplanet inte kan komma in i detektionsnålhålet.
Det enkla uttrycket för arbetsprincipen för laserkonfokal är att den använder laser som ljuskälla, och på basis av traditionell fluorescensmikroskopavbildning, lägger den till en laserskanningsanordning och en konjugerad fokuseringsanordning, och är ett system för digital bildinsamling och bearbetning genom datorstyrning.
