Skillnader och egenskaper mellan fluorescensmikroskop och vanligt optiskt mikroskop
Fluorescensmikroskop skiljer sig från vanligt optiskt mikroskop. Den observerar inte provet genom belysning av en vanlig ljuskälla. Istället använder den ljus av en viss våglängd (vanligtvis ultraviolett ljus, blåviolett ljus) för att excitera det fluorescerande materialet i provet under mikroskopet, vilket får det att avge fluorescens. Därför fungerar ljuskällan i ett fluorescensmikroskop inte som direkt belysning, utan som en energikälla som exciterar det inre fluorescerande materialet i provet. Anledningen till att vi kan observera provet beror inte på belysningen av ljuskällan, utan på fluorescensfenomenet som orsakas av att det fluorescerande materialet i provet absorberar den exciterade ljusenergin. Det kan ses att det huvudsakliga kännetecknet för ett fluorescensmikroskop är att dess ljuskälla kan tillföra en stor mängd excitationsljus i ett specifikt våglängdsområde, så att de fluorescerande ämnena i provet som undersöks kan erhålla den nödvändiga intensiteten av excitationsljus. Samtidigt måste fluorescensmikroskop ha motsvarande filtersystem. Fluorescensmikroskopi är ett viktigt verktyg för avancerad fluorescenshistokemi. Den består av ultrahögtrycksljuskälla, filtersystem (inklusive excitations- och undertryckningsfilterplattor), optiskt system och fotografisystem. Den använder ljus av en viss våglängd för att excitera provet för att avge fluorescens.
1. Sätt att excitera fluorescens: Enligt ljusets våglängdsområde är det uppdelat i två typer: UV-exciteringsmetod (med ultraviolett belysningsmetod) och BV-excitationsmetod (med blåviolett ljus). UV-exciteringsmetoden använder nära-ultraviolett ljus kortare än 400nm för excitation. Det finns inget synligt excitationsljus i denna metod, så den observerade fluorescensen visar färgämnets inneboende fluorescens, vilket gör det lätt att skilja den specifika fluorescensen på provet från autofluorescensen i bakgrundsvävnaden.
2. BV-exciteringsmetod: excitation från ultraviolett till blått ljus centrerat vid 404nm och 434nm. Denna metod använder blått ljus för att belysa provet, så cut-off-filtret i fluorescensobservationssystemet måste använda ett filter som helt kan blockera blått ljus och helt klara den gröna och gula fluorescensen. Fluorescerande färgämnen som används i fluorescerande antikroppsmetoder. Den maximala absorptionsvåglängden för excitationsljus och den maximala emissionsvåglängden för fluorescens är relativt nära, så filtret som används i BV-excitationsmetoden måste använda ett skarpt cutoff-filter. Denna metod kan använda blått ljus som excitationsljus, så absorptionseffektiviteten för fluorescerande pigment är högre och ljusare bilder kan erhållas. Nackdelen är att fluorescens under 500nm inte kan ses, medan fluorescens över 500nm gör att hela bilden ser gul ut. I metoden med fluorescerande antikroppar bedöms specificiteten hos det fluorescerande färgämnet mestadels av dess unika färg. Därför, när man diskuterar den subtila specificiteten, har de ovan nämnda bristerna med BV-excitationsmetoden ofta stor inverkan.
