Direkträkning med mikroskop för mikrober
Experimentell princip
Direkt räkning i mikroskop med hjälp av en hemocytometer är en vanlig mikrobiell räkningsmetod. Fördelen med denna metod är att den är intuitiv och snabb. Placera den lämpligt utspädda bakteriesuspensionen (eller sporsuspensionen) i räknekammaren mellan objektglaset och hemocytometerns täckglas och räkna under mikroskop. Eftersom volymen på räknekammaren är fixerad (0,1 mm2), kan den omvandlas till det totala antalet mikroorganismer per volymenhet enligt antalet mikroorganismer som observeras under mikroskopet. Eftersom denna metod räknar summan av levande och döda bakterier, kallas den också för totala bakterieräkningsmetoden.
En hemocytometer är vanligtvis en speciell glasskiva på vilken fyra spår bildar tre plattformar. Plattformen i mitten är uppdelad i två halvor av ett kort horisontellt spår. Ett rutnät är ingraverat på plattformen på varje sida. Varje rutnät är uppdelat i nio stora rutor. Det stora torget i mitten är räknerummet. Mikroorganismer räknas i räknekammaren. Strukturen för blodcellsräkningsbrädan visas i figur Ⅷ-1.
Räknerummets skala har i allmänhet två specifikationer, den ena är att en stor ruta är uppdelad i 16 mittersta rutor, och varje mellanruta är uppdelad i 25 små rutor (Figur Ⅷ-2); den andra är en stor kvadrat. Fyrkanten är uppdelad i 25 mittersta rutor, och varje mittersta rutor är uppdelad i 16 små rutor (Figur Ⅷ-1, C). Men oavsett vilken typ av räknebräde det är, är antalet små rutor i varje stor ruta detsamma, det vill säga 16×25=400 små rutor, som visas i figur Ⅷ-2.
Sidans längd på varje stor kvadrat är 1 mm, och arean på varje stor kvadrat är 1 mm2. Efter att täckglaset har täckts är höjden mellan glidglaset och täckglaset 0,1 mm, så volymen på räknekammaren är 0,1 mm3.
När du räknar räknar du vanligtvis det totala antalet bakterier i de fem mittersta kvadraterna, erhåller sedan medelvärdet för varje mittersta kvadrat och multiplicerar sedan med 16 eller 25 för att få det totala antalet bakterier i en stor kvadrat, och konverteras sedan till totalt antal bakterier i 1 ml bakterielösning.
Laboratorieutrustning
Hemocytometer, mikroskop, täckglas, steril kapillär;
Experimentellt material
Saccharomyces cerevisiae suspension
Experimentell procedur (mikrobiellt mikroskop direkt räkningsmetod)
1. utspädning
Späd Saccharomyces cerevisiae-suspensionen ordentligt. Om bakterielösningen inte är tjock behöver den inte spädas ut.
2. Mikroskopiskt räknerum
Innan du lägger till prover, utför en mikroskopisk inspektion av räkneplattans räknekammare. Om det finns smuts måste det rengöras innan man räknar.
3. lägg till prov
Täck den rena och torra hemocytometerplattan med ett täckglas och använd sedan en steril dropppipa med fin mun för att droppa en liten droppe av den utspädda Saccharomyces cerevisiae-lösningen från kanten av täckglaset (inte för mycket), så att bakterielösningen är nära springan längs springan. Kapillär osmos kommer in i räknekammaren av sig själv, och den allmänna räknekammaren kan fyllas med bakteriell vätska. Var försiktig så att du inte får luftbubblor.
4. mikroskopräkning
Efter vila i 5 minuter, placera hemocytometern på mikroskopets scen, använd först en lågeffektlins för att hitta platsen för räknekammaren och byt sedan till en högeffektslins för räkning. Om det visar sig att bakterielösningen är för tjock eller för tunn innan räkning, är det nödvändigt att justera utspädningen igen innan räkning. I allmänhet kräver provspädningen ungefär 5-10 bakterier i varje cell. Varje räknekammare väljer bakterierna i 5 mittersta galler (valfritt 4 hörn och centrala galler) för räkning. Bakterierna på rutnätslinjen räknas i allmänhet bara på de övre och högra linjerna. Vid jästknoppning, när knoppkroppens storlek når hälften av modercellen, räkna två bakterier. Räkna ett prov för att beräkna bakterieinnehållet i provet från värdena som räknats i de två räknekamrarna.
5. Rengöring av hemocytometern
Efter användning, skölj blodcellsräkneplattan på kranen med vattenstrålar, tvätta den inte med hårda föremål och torka den själv eller med en hårtork efter tvätt. Mikroskopisk undersökning, observera om det finns kvarvarande bakterier eller andra sediment i varje cell. Om den inte är ren måste den tvättas upprepade gånger tills den är ren.
