Funktioner och tillämpningar av konfokal lasermikroskopi
Laser scanning confocal microscope (LSCM) är en typ av mikroskop designad baserat på konjugerad fokusteknologi, det vill säga att göra laserljuskällan, provet som testas och detektorn alla i konjugerade positioner för varandra.
Grundläggande
I allmänna mikroskop sammanfaller objektivlinsens fokalplan med detektorn så att det observerade bildplanet är isolerat från det intilliggande axialplanet, medan i konfokala mikroskop belyses provet med hjälp av en diffraktionsbegränsad ljusfläck, och i Denna isoleringseffekt uppnås genom att använda ett nålhål i uppsamlingsljusbanan vid punktkonjugatets brännpunkt för att filtrera ströljus för att förbättra upplösningen.
Bildfunktioner
Endast ljuset som reflekteras tillbaka från det konjugerade provlagret kan passera genom det lilla hålet i uppsamlingsljusbanan, och de återstående irrelevanta provlagerreflektionerna blockeras av det lilla hålet. Detta kan resultera i en betydande ökning av upplösningen. Nedan visas en jämförelse sida vid sida av multidimensionell fluorescensmikroskopi och konfokalmikroskopi av samma tjocka prov. När en serie bilder tas i olika fokalplan kan det som vanligtvis kallas en "z-stack" genereras, och denna bild visar både upplösningen och kontrastförstärkningarna som erbjuds av konfokalmikroskopi och de bakomliggande orsakerna till dessa förstärkningar. Att undersöka bilden överst i stapeln med avbildningsplanet ovanför vävnaden avslöjar mycket spritt ljus i fluorescensbilden, medan den konfokala bilden ser svart ut. Denna minskning av PSF i axiell riktning är direkt ansvarig för skillnaden i upplösning som observeras vid det optiska gränssnittet i mitten av z-stacken.
En annan egenskap hos laserskanningskonfokalmikroskopi är att det är en skanningsteknik. Den traditionella bredfältsbelysningsteknologin belyser hela provet, så att bilden kan fångas direkt med blotta ögat eller en detektor, men LSCM använder en stråle eller Flera fokuserade strålar passerar genom provet för skanning och avbildning, och den resulterande bilden är kallas en optisk sektion. Följande visar skillnaden mellan den traditionella bredfältsbelysningsmetoden och laserskanningsmetoden för konfokal belysning.
Därför visas en praktisk arbetsmetod för ett modernt konfokalmikroskop i figuren nedan. Excitationsljuset som emitteras av lasern passerar genom en dikroisk spegel och skannar i x- och y-riktningarna av provet genom ett par vibrerande speglar. Excitationen (eller reflektionen) av provet. Ljuset kommer in i PMT-detektorn genom hålet och registreras, och den inspelade skanningsbilden rekonstrueras av datorn för att erhålla den faktiska provbilden.
