Hur kan du välja rätt konfokalmikroskop för dig? Finns det någon specifik metod?
Konfokalmikroskopi har fler fördelar än bredfältsmikroskopi. Konfokalmikroskopi kan göra kontinuerlig optisk sektionering av prover och utesluta signalstörningar från icke-fokala plan. Av denna anledning är tillämpningen av konfokalmikroskopi verkligen vanligare. Det finns dock fler och fler konfokalmikroskop på marknaden. Hur väljer man?
Konfokalmikroskopi har fler fördelar än bredfältsmikroskopi. Konfokalmikroskopi kan göra kontinuerliga optiska sektioner av prover och utesluta signalinterferens från icke-fokala plan. Av denna anledning är konfokalmikroskopi verkligen vanligare. Det finns dock fler och fler konfokalmikroskop på marknaden. Hur väljer man? När du väljer ett konfokalmikroskop finns det två grundläggande och viktiga överväganden: vilken typ av prov du vill studera (t.ex. fasta eller levande celler) och vilken typ av analys du vill utföra (t.ex. statiska eller dynamiska cellulära processer).
Konfokal avbildning av fixerade celler
För att avbilda fixerade och färgade celler eller vävnader väljer vi i allmänhet laserskanning konfokal (LSCM). Detta beror främst på att fixerade döda celler saknar snabba biologiska händelser i levande celler och bättre kan dra nytta av den högre rumsliga upplösningen av LSCM. LSCM-avbildning är att optiskt skära provet med laser, och skanningshastigheten (beroende på hastigheten hos skanningsmatrisspegeln) är i allmänhet 1 fps. Längre exponeringstider innebär en större risk för fotoblekning, men för fasta döda celler är tiden inte kritisk och vi kan utvärdera den genom att ta flera bilder.
Konfokal avbildning av levande celler
Avbildning av levande celler kräver ytterligare skydd från ovänliga miljöer. Vid avbildning är vårt första övervägande att upprätthålla cellviabilitet och hälsa. Värmeelement med konstant temperatur och perfusionssystem är väsentliga, särskilt för time-lapse-studier. De snabba biokemiska händelserna som styr det fysiologiska tillståndet hos levande celler är vad de flesta människor vill studera, men dessa händelser är för snabba för konventionell LSCM. Dessutom inducerade långvarig exponering för LSCM också toxisk ljusskada på celler. Därför kräver avbildning av levande celler speciella konfokala mikroskop.
Det finns i allmänhet två alternativ för konfokal avbildning av levande celler: snabbskannande laserskanningskonfokaler och roterande diskkonfokaler. Snabb skanningskonfokalmikroskopi ersätter långsammare galvanometerspeglar med snabbare resonansavsökningsspeglar, vilket möjliggör skanningshastigheter på upp till 30 fps; medan spinnande diskkonfokaler (SDCM) har fördelen av snabbare skanning (även om oundvikligen med förlust Spatial resolution), kan dess hastighet teoretiskt nå 2000 fps (i praktiken begränsas den ofta av andra faktorer).
Om du är orolig för fotoblekning eller mycket svag fluorescenssignal kan SDCM vara mer lämpligt. SDCM använder två roterande skivor med arrangerade mikrobrunnar för att sprida excitationsljuset. Till skillnad från LSCM, som skannar provfläcken, förvärvar SDCM flera fläckar åt gången (cirka 100 pixelfläckar), så hastigheten ökar kraftigt, och fotoblekning av SDCM och mindre fototoxicitet. Men du kan också använda snabba skanningskonfokaler för att öka skanningshastigheten, kombinerat med mycket känsliga detektorer, och minska excitationsljusenergin för att minska fototoxiciteten, vilket kan bibehålla de rika funktionerna hos traditionella konfokaler.
Automatiserat konfokalt bildsystem
Vissa forskare gillar att hitta sätt att modifiera mikroskopet för att passa deras individuella behov. Och vissa forskare är inte ens intresserade av hur mikroskop faktiskt fungerar. För de senare kan ett automatiserat konfokalmikroskop falla mer i smaken. Till exempel är Olympus FluoViewFV10i ett sådant helautomatiskt 4-konfokalt lasermikroskop för skrivbordet. Dess kompakta integrerade struktur kräver nästan inget installationsutrymme. Den här typen av instrument är idealisk för forskare som behöver göra mycket bilddatainsamling varje dag, men de återspeglar naturligtvis inte helt funktionaliteten och flexibiliteten hos traditionella konfokaler. Dessutom är NikonA1 också ett helautomatiskt konfokalsystem. Liksom de flesta konventionella konfokala skanningsmikroskop använder NikonA1 ett galvanometeravsökningshuvud, som har en högre upplösning än A1R med ett hybridavsökningshuvud, men en något lägre hastighet (A1R ~30fps)
