Kunskap om två-fotonfluorescensmikroskopi
Grundprincipen för två-fotonexcitation är att vid hög fotondensitet kan fluorescerande molekyler samtidigt absorbera två långa våglängdsfotoner och emittera en kortare våglängdsfoton efter en kort period av så-exiterad livstid; Effekten är densamma som att använda en foton med halva våglängden av den långa våglängden för att excitera fluorescerande molekyler. Excitation av två fotoner kräver en hög fotondensitet, och för att undvika att skada celler använder två-fotonmikroskopi hög-energiläge-låsta pulslasrar. Lasern som emitteras av denna laser har hög toppenergi och låg medelenergi, med en pulsbredd på endast 100 femtosekunder och en frekvens på upp till 80 till 100 megahertz. När du använder en objektivlins med hög numerisk bländare för att fokusera fotonerna i en pulsad laser, är fotondensiteten vid objektivlinsens brännpunkt högst, och excitation av två{11}}fotoner sker endast vid objektivlinsens brännpunkt. Därför kräver två-fotonmikroskopet inget konfokalt nålhål, vilket förbättrar effektiviteten av fluorescensdetektion.
I allmänna fluorescensfenomen, på grund av den låga fotondensiteten hos excitationsljuset, kan en fluorescerande molekyl endast absorbera en foton åt gången och sedan avge en annan fluorescerande foton genom strålningsövergång, vilket är känt som enkelfotonfluorescens. För fluorescensexcitationsprocesser som använder lasrar som ljuskällor kan två-foton- eller till och med multifotonfluorescensfenomen förekomma. I det här fallet har den använda excitationsljuskällan hög intensitet och fotondensitet som uppfyller kravet på att fluorescerande molekyler ska absorbera två fotoner samtidigt. I processen att använda en allmän laser som excitationsljuskälla är fotondensiteten fortfarande otillräcklig för att producera två-fotonabsorptionsfenomen. Vanligtvis används femtosekundspulslasrar, med momentan effekt som når megawattnivån. Därför är våglängden för två-fotonfluorescens kortare än den för excitationsljus, vilket motsvarar effekten som produceras av halv excitationsvåglängdsexcitation.
