Låg kostnad fluorescens och ljusfältsmikroskopdesign
Fluorescensmikroskopi är en metod som används för att visualisera
I den här guiden kommer jag att gå igenom grunderna för fluorescensmikroskopi och hur man bygger tre olika billiga fluorescensmikroskop. Dessa system kostar vanligtvis tusentals dollar, men det har gjorts några ansträngningar på senare tid för att göra dem mer tillgängliga. Designen jag presenterar här använder en smartphone, dSLR och USB-mikroskop. Alla dessa mönster kan också användas som ljusfältsmikroskop.
Steg 1: Översikt över fluorescensmikroskopi
För att förstå de grundläggande koncepten för fluorescensmikroskopi, föreställ dig en tät skog på natten, med träd, djur, buskar och andra levande skogar. Om du lyser in en fackla i skogen kommer du att se alla dessa strukturer och ha svårt att visualisera specifika djur eller växter. Anta att du bara är intresserad av att se blåbärsbuskar i skogen. För att göra detta tränar du eldflugan att bara attraheras av blåbärsbuskar, så att när du tittar på skogen lyser bara blåbärsbuskarna upp. Man kan säga att man använder eldflugor för att markera blåbärsbuskar så att man kan se blåbärsstrukturer i skogen.
I denna analogi representerar skogen hela provet, blåbärsbuskarna representerar de strukturer du vill visualisera (t.ex. specifika celler eller subcellulära organeller), och eldflugorna är fluorescerande föreningar. Att belysa facklan ensam utan eldflugorna liknar ljusfältsmikroskopi.
Nästa steg är att förstå den grundläggande funktionen hos fluorescerande föreningar (även känd som fluoroforer). Fluoroforer är faktiskt små föremål (nanoskala) utformade för att koppla samman specifika strukturer i ett prov. De absorberar ett smalt intervall av ljusvåglängder och återutsänder ytterligare en våglängd av ljus. Till exempel kan en fluorofor absorbera blått ljus (dvs. fluoroforen exciteras av blått ljus) och sedan återutsända grönt ljus. Detta sammanfattas vanligtvis av excitations- och emissionsspektra (ovan). Dessa diagram visar våglängden för ljus som absorberas av fluoroforen och våglängden för ljus som emitteras av fluoroforen.
Mikroskopdesignen är mycket lik den för ett normalt ljusfältsmikroskop, med två huvudsakliga skillnader. För det första måste ljuset som lyser upp provet ha den våglängd som exciterar fluoroforen (för exemplet ovan är ljuset blått). För det andra behöver mikroskopet bara samla upp det emitterade ljuset (grönt ljus) samtidigt som det blockerar det blå ljuset. Detta beror på att blått ljus finns överallt, men grönt ljus kommer bara från specifika strukturer i provet. För att blockera blått ljus har mikroskop vanligtvis något som kallas ett långpassfilter som låter grönt ljus passera utan blått ljus. Varje långpassfilter har en gränsvåglängd. Om ljuset har en våglängd längre än cut-off våglängden kan det passera genom filtret. Därav namnet, "långpass". Kortare våglängder blockeras.
Steg 2: Modellering av mikroskopet med optisk optik
Detta är ett ytterligare steg till de grundläggande principerna för mikroskopdesign. Det finns inget behov av att bygga ett fluorescensmikroskop, så du kan hoppa över det om du inte vill fördjupa dig i optik.
Både ljusfälts- och fluorescensmikroskop kan modelleras med hjälp av stråloptik. Den grundläggande premissen för stråloptik är att ljus beter sig på samma sätt som ljus som reser bort från en ljuskälla. När du tittar dig omkring i ett rum ser du ljus från solljus utanför ett fönster eller från en glödlampa. Ljuset absorberas eller reflekteras sedan av föremål i rummet. En del av det reflekterade ljuset gör att det riktas mot dina ögon. Om objektet är upplyst kan du föreställa dig att varje punkt på objektet avger ljus i alla riktningar (ovan). Linsen, som linsen i våra ögon, fokuserar ljuset till en punkt så att vi kan se objektet. Utan en lins fortsätter ljuset att färdas utåt och bildar ingen bild.
Så hur gör vi optiska system som förstorar små föremål? För att förstå designen behöver du egentligen bara känna till två ekvationer: tunnlinsavbildningen och förstoringsekvationerna:
1/f=1/si + 1/så
M=-si/so
f är objektivets brännvidd. En kortare brännvidd betyder att objektivet har mer fokuseringsförmåga.
Detsamma gäller för objektavstånd; avståndet mellan linsen och föremålet (t.ex. ett träd).
si är bildavståndet; avståndet mellan linsen och där bilden bildas
M är förstoring; hur stor bilden är i förhållande till objektet. För mikroskop vill vi öka förstoringen.
För en fullständig handledning om ekvationen med tunna linser, kolla in denna Khan Academia-video. I gif:en ovan kan du se att avståndet som objektet rör sig närmare linsen ökar bildavståndet, vilket ökar förstoringen. Den vertikala linjen med två pilar indikerar linsen.
