Metoder för att förlänga bränndjupet för multifotonmikroskop
Kombinationen av två-fotonlasermikroskop och kalciumindikator är guldstandarden för in vivo neuronal signaldetektering. Neuronerna i neurala nätverk är fördelade i tre-dimensionellt utrymme, och övervakning av deras aktivitetsdynamik kräver ett sätt att snabbt förbättra volymavbildningshastigheten. Om man använder ett multifotonmikroskop med galleravsökning för att avbilda ett stort antal bilder, om ett objektiv med hög numerisk bländare (NA) används för att uppnå högre lateral upplösning, kommer det att resultera i ett mindre bränndjup. För att erhålla volymavbildning vid ett litet bränndjup,
Det är nödvändigt att utföra Z--axelskanning på något sätt, avbilda många plan genom att skanna varje fokalplan, vilket kraftigt begränsar bildhastigheten. Om axiell bildinformation kan offras och volymskanning kan uppnås i en lateral skanning genom att utöka fokusdjupet, det vill säga volyminformationen projiceras på en enda 2D-bild, kan bildhastigheten förbättras avsevärt. Detta kallas EDF-avbildning (Extended Depth of Focus), vilket är särskilt användbart för att avbilda glesa befolkningsstrukturer som kräver hög tidsupplösning, såsom funktionell avbildning av neuronal aktivitet.
De axiella och laterala upplösningarna för ett mikroskop bestäms av den numeriska bländaren (NA) hos objektivlinsen. Hög NA kan maximera axiell och lateral upplösning såväl som mängden ljus som samlas in; Lägre NA kommer att resultera i lägre axiell upplösning, dvs längre fokusdjup, men samtidigt offra sidoupplösning och ljusuppsamlingseffektivitet. Metoden för att utöka fokusdjupet som kommer att introduceras härnäst kan uppnå detta samtidigt som hög lateral upplösning och tillräckligt ljusflöde bibehålls.
Användningen av rumsliga ljusmodulatorer för att generera fokala smala Bessel-strålar kan uppnå EDF-avbildning, men rumsliga ljusmodulatorer är skrymmande och svåra att vara kompatibla med smala mikroskoputrymmen; Däremot är Bessel-moduler baserade på axiella pyramider billiga och kompakta, men de kan bara generera brännpunkter med fast djup och är inte lämpliga för olika experiment som kräver kontinuerliga förändringar i bränndjupet. För att ta itu med denna fråga, under 2018, RONGWEN LU et al. demonstrerade en Bessel-modul baserad på ett axicon, där endast en lins behöver översättas längs den optiska axeln för att kontinuerligt justera den axiella längden på Bessel-brännpunkten.
Figur 1 (a) Bessel-modulenhetsdiagram; (b) Punktspridningsfunktionen mättes experimentellt när D var -12 mm, 0 mm respektive 12 mm; (c) Förhållandet mellan lateral full bredd vid halva maximum, (d) axiell full bredd vid halva maximum, (e) toppsignal och (f) optisk effekt bakom objektivlinsen med L2-förskjutning D
Modulanordningen för att bilda en Bessel-fokuspunkt med variabel längd visas i figur la. Den infallande Gaussstrålen formas till en cirkulär stråle efter att ha passerat genom en axel och lins L1. Den efterföljande cirkulära aperturmasken kan blockera ströljus orsakat av axikondefekter, och därigenom forma den axiella fördelningen av två-fotonexcitationspunktsspridningsfunktionen. Efteråt projiceras ljusstrålen på galvanometern av linserna L2 och L3, och når sedan objektivlinsens bakre fokalplan genom linserna L4 och L5.
Dessa konstruktioner liknar traditionella pyramidbaserade moduler, med skillnaden att genom att flytta L2 eller L3 längs den optiska axeln kan den axiella längden på Bessel-fokuset justeras kontinuerligt. Figur 1b visar de axiella punktspridningsfunktionerna för D-värden på -12 mm, 0 mm och 12 mm, med axiell full bredd vid halva maximalt 39? m,24? M och 14? m. Som visas i figur 1c-f kan en förflyttning av linsen L2 från vänster till höger kontinuerligt ändra hela bredden till halva maximum i både tvärgående och axiella riktningar, vilket innebär att fokusdjupet kan ändras kontinuerligt. De numeriska simuleringsresultaten baserade på vektordiffraktionsteori stämmer väl överens med experimentella data. Figur 2 verifierar korrigeringseffekten av olika storlekar av ringformiga masker på axicondefekter. Det har visat sig att tunnare ringformiga masker bättre kan optimera den axiella intensitetsfördelningen av den utgående Bessel-strålen, men samtidigt leder de också till mer effektförlust.
