Mikroskopisk klassificering och arbetsprincip för cellforskning
Mikroskopet är det primära verktyget för att observera celler. Enligt olika ljuskällor kan den delas in i två kategorier: optiska mikroskop och elektronmikroskop. Den förra använder synligt ljus (UV-mikroskop använder ultraviolett ljus) som ljuskälla, medan den senare använder elektronstrålar som ljuskälla.
-,Optiskt mikroskop
(1) Vanligt optiskt mikroskop
Vanliga biologiska mikroskop består av tre delar, nämligen: ① belysningssystem, inklusive ljuskälla och kondensor; ② optiskt förstoringssystem, som består av objektivlins och okular, som är huvuddelen av mikroskopet. För att eliminera sfärisk aberration och kromatisk aberration, används både okularet och objektivet ③Mekanisk anordning för att fixera materialet och underlätta observation (Figur 2-1).
Huruvida bilden av mikroskopet är tydlig bestäms inte bara av förstoringen, utan också relaterat till mikroskopets upplösning. Upplösningen hänvisar till förmågan hos mikroskopet (eller det mänskliga ögat att vara 25 cm från målet) att särskilja det minsta avståndet mellan föremål. Storleken på upplösningen bestäms av ljusets våglängd och aperturförhållande och mediets brytningsindex uttrycks med formeln:
I formeln: n=brytningsindex för medium;=bländarvinkel (provets öppningsvinkel mot objektivets bländare), NA=objektivbländare (numerisk bländare). Linsvinkeln är alltid mindre än 180 grader, så maxvärdet för sina/2 måste vara mindre än 1.
Brytningsindexet för glaset som används för att göra den optiska linsen är 1,65 till 1,78, och brytningsindexet för mediet som används är närmare glaset, desto bättre. För torra objektiv är mediet luft och objektivets bländarförhållande är i allmänhet 0.05 till 0,95; för oljelinser används cederolja som medium och objektivets bländarförhållande kan vara nära 1,5.
Våglängden för vanligt ljus är {{0}}nm, så upplösningsvärdet för mikroskopet kommer inte att vara mindre än 0.2μm, och upplösningen för det mänskliga ögat är 0,2 mm, så maximal förstoring av den allmänna mikroskopdesignen är vanligtvis 1000X.
(2) Fluorescensmikroskopi
Vissa ämnen i celler, som klorofyll, kan fluorescera efter att ha blivit bestrålade av ultravioletta strålar; vissa ämnen kan inte själva fluorescera, men om de är färgade med fluorescerande färgämnen eller fluorescerande antikroppar kan de också fluorescera när de bestrålas av ultravioletta strålar, och fluorescensmikroskopet (Fig. 2-2, 3, 4) är ett av verktygen för kvalitativ och kvantitativ forskning om sådana ämnen.
Fluorescensmikroskop och vanliga mikroskop har följande skillnader:
1. Belysningsmetoden är vanligtvis epi-belysning, det vill säga ljuskällan projiceras på provet genom objektivlinsen (Figur 2-3);
2. Ljuskällan är ultraviolett ljus, våglängden är kortare och upplösningen är högre än för vanliga mikroskop;
3. Det finns två specialfilter, det som är framför ljuskällan används för att filtrera bort synligt ljus och det mellan okularet och objektivlinsen används för att filtrera bort ultraviolett ljus för att skydda ögonen.
(3) Laser scanning konfokalmikroskop
Laserkonfokalt scanningsmikroskop (laserkonfokalt scanningsmikroskop, figur 2-5, 6) använder laser som skanningsljuskälla och skannar avbildning punkt för punkt, linje för linje, yta för yta, och skanningslaser- och fluorescenssamlingen delar en objektivlinsen, och objektivets fokus är Fokuspunkten för skanningslasern är också objektspunkten för momentan avbildning. Eftersom våglängden på laserstrålen är kort och strålen är mycket tunn, har det konfokala laserskanningsmikroskopet en högre upplösning, vilket är ungefär 3 gånger den hos ett vanligt optiskt mikroskop. Systemet fokuseras en gång och skanningen är begränsad till ett plan av provet. När fokuseringsdjupet är annorlunda kan bilder av olika djupnivåer av provet erhållas. Denna bildinformation lagras i datorn. Genom datoranalys och simulering kan cellprovets tredimensionella struktur visas.
Konfokal laserskanningsmikroskopi kan användas inte bara för att observera cellmorfologi, utan också för kvantitativ analys av intracellulära biokemiska komponenter, optisk densitetsstatistik och mätning av cellmorfologi.
(4) Mörkfältsmikroskop
Mörktfältsmikroskopet (mörkfältsmikroskop, figur 2-7) har ett ljusark i mitten av kondensorn, så att belysningsljuset inte direkt kommer in i den mänskliga linsen, och endast ljuset som reflekteras och diffrakteras av provet tillåts komma in i objektivlinsen, så bakgrunden av synfältet är svart, kanterna på objekt är ljusa. Med detta mikroskop kan partiklar så små som 4-200nm ses och upplösningen kan vara 50 gånger högre än för vanliga mikroskop.
(5) Faskontrastmikroskop
Faskontrastmikroskop (faskontrastmikroskop, figur 2-8, 9) av P. Zernike uppfanns 1932 och vann Nobelpriset i fysik 1953 för det. Den största egenskapen hos detta mikroskop är att det kan observera ofärgade prover och levande celler.
Den grundläggande principen för faskontrastmikroskopi är att ändra den optiska vägskillnaden för det synliga ljuset som passerar genom provet till en amplitudskillnad, och därigenom förbättra kontrasten mellan olika strukturer och göra olika strukturer tydligt synliga. Efter att ha passerat genom provet bryts ljuset, avviker från den ursprungliga optiska banan och fördröjs med 1/4λ (våglängd). Förstärk, öka eller minska amplituden, öka kontrasten. När det gäller struktur har faskontrastmikroskop två speciella egenskaper som skiljer sig från vanliga optiska mikroskop:
1. Det ringformiga membranet är placerat mellan ljuskällan och kondensorn och dess funktion är att få ljuset som passerar genom kondensorn att bilda en ihålig ljuskon och fokusera på provet.
2. Fasplattan (ringformig fasplatta) lägger till en fasplatta belagd med magnesiumfluorid i objektivlinsen, vilket kan fördröja fasen för direkt ljus eller diffrakterat ljus med 1/4λ. Det finns två typer:
①A plus fasplatta: Det direkta ljuset är fördröjt med 1/4λ. Efter att de två grupperna av ljusvågor har kombinerats läggs ljusvågorna samman och amplituden ökas. Strukturen på provet är ljusare än det omgivande mediet och bildar en ljus kontrast (eller negativ kontrast).
② B plus fasplatta: Det diffrakterade ljuset är fördröjt med 1/4λ. Efter att de två uppsättningarna av strålar har kombinerats, subtraheras ljusvågorna, och amplituden blir mindre och bildar en mörk kontrast (eller positiv kontrast), och strukturen är mörkare än det omgivande mediet.
(6) Polariserande mikroskop
Polariserande mikroskop används för att upptäcka ämnen med dubbelbrytning, såsom filament, spindlar, kollagen, kromosomer och så vidare. Skillnaden mot vanliga mikroskop är att det finns en polarisator (polarisator) framför ljuskällan, så att ljuset som kommer in i mikroskopet är polariserat ljus, och det finns en analysator (en polarisator vars polarisationsriktning är vinkelrät mot polarisatorn) i linshylsan. Steget i detta mikroskop kan roteras. När en enkelbrytande substans placeras på scenen, oavsett hur scenen roteras, eftersom de två polarisatorerna är vertikala, kan inget ljus ses i mikroskopet och ljuset är inte synligt i mikroskopet. När det går in i dubbelbrytande material kan det roterande steget upptäcka sådana föremål eftersom ljuset avleds när det passerar genom sådana material.
