Princip och konstruktion av fluorescensmikroskop
Fluorescensmikroskop använder en punktljuskälla med hög ljuseffektivitet, som avger en viss våglängd av ljus (som ultraviolett ljus 3650 tum eller violett blått ljus 4200 tum) genom ett färgfiltreringssystem som excitationsljus, och exciterar de fluorescerande ämnena i provet för att avger olika färger av fluorescens. Därefter observeras det genom förstoring av objektivet och okularet. På så sätt, även med svag fluorescens, är den lätt att känna igen och mycket känslig under starkt kontrasterande bakgrunder, främst för att studera cellstruktur och funktion, samt kemisk sammansättning. Den grundläggande strukturen för ett fluorescensmikroskop är sammansatt av ett vanligt optiskt mikroskop och vissa tillbehör (som en fluorescerande ljuskälla, excitationsfilter, bikromatisk strålseparator och blockeringsfilter, etc.). Fluorescerande ljuskällor - använder vanligtvis kvicksilverlampor med ultrahögt tryck (50-200W), som kan avge ljus med olika våglängder. Varje fluorescerande ämne har dock en excitationsljusvåglängd som producerar den starkaste fluorescensen, så excitationsfilter (vanligtvis ultravioletta, lila, blåa och gröna excitationsfilter) måste läggas till för att endast tillåta en viss våglängd av excitationsljus att passera igenom och belysa provet, samtidigt som allt annat ljus absorberas. Efter att ha bestrålats med exciterat ljus avger varje ämne synlig fluorescens med en längre våglängd än bestrålningen på mycket kort tid. Fluorescens har specificitet och är i allmänhet svagare än excitationsljus. För att observera specifik fluorescens måste ett blockerande (eller undertryckande) filter läggas till bakom objektivlinsen. Den har två funktioner: för det första absorberar och blockerar den excitationsljus från att komma in i okularet för att undvika störande fluorescens och skada ögonen; för det andra väljer den och låter specifik fluorescens passera igenom, och visar en specifik fluorescensfärg. Båda typerna av filter måste väljas för användning tillsammans.
Det finns två typer av fluorescensmikroskop baserat på deras optiska väg:
1. Transmissionsfluorescensmikroskop: Excitationsljuskällan överförs genom provmaterialet genom en kondensor för att excitera fluorescens. Vanligt använda mörkfältsljussamlare, eller vanliga ljussamlare, kan användas för att justera reflektorn för att omvandla excitationsljus och sidoljus till provet. Detta är ett relativt gammaldags fluorescensmikroskop. Dess fördel är att fluorescensen är stark vid låg förstoring, medan dess nackdel är att fluorescensen försvagas när förstoringen ökar. Därför är det bättre att observera större provmaterial.
2. Fallande stråle fluorescensmikroskop Detta är en ny typ av fluorescensmikroskop som utvecklats i modern tid. Till skillnad från den föregående faller excitationsljuset ner från objektivlinsen till ytan av provet, med samma objektivlins som belysningskondensorn och objektivlinsen för att samla fluorescens. En strålseparator med två färger måste läggas till den optiska vägen, som är i 45 graders vinkel mot det lätta uranet. Excitationsljuset reflekteras in i objektivlinsen och koncentreras på provet. Fluorescensen som genereras av provet, såväl som excitationsljuset som reflekteras från ytan av objektivlinsen och täckglaset, kommer in i objektivlinsen samtidigt och återgår till den dikroiska strålseparatorn, vilket separerar excitationen och fluorescensen. Den kvarvarande excitationen absorberas sedan av blockeringsfiltret. Om olika excitationsfilter/dubbelfärgade strålseparatorer/blockerande filterkombinationer används kan de tillgodose behoven hos olika fluorescerande reaktionsprodukter. Fördelen med detta fluorescerande mikroskop är att synfältsbelysningen är enhetlig, avbildningen är tydlig och ju större förstoring, desto starkare fluorescens.
