Principer för konfokalmikroskopi
Konfokalmikroskop är ett högprecisionsavbildningsinstrument som växte fram och utvecklades på 1980-talet och är ett väsentligt vetenskapligt forskningsinstrument för att studera submikronstrukturer. Med utvecklingen av datorer, bildbehandlingsprogram och lasrar har även konfokalmikroskop genomgått en stor utveckling, och används nu flitigt inom områdena biologi, mikrosystem och materialmätning. Konfokalmikroskop är en ny typ av mikroskop som integrerar konfokalprincip, skanningsteknik och datorgrafikbehandlingsteknik. Dess främsta fördelar är: hög lateral upplösning och hög axiell upplösning, och effektiv dämpning av ströljus, med hög kontrast.
En typisk konfokalmikroskopinställning är att placera två små hål på det konjugerade planet i fokalplanet för det uppmätta objektet, varav det ena placeras framför ljuskällan och det andra placeras framför detektorn, som visas i figuren. 1. Det kan ses från figuren att när det uppmätta provet är i kvasi-fokusplanet är ljusintensiteten som samlas in av detekteringsänden störst; när det uppmätta provet är i ofokuserat läge diffunderar ljuspunkten vid detekteringsänden och ljusintensiteten minskar snabbt. Därför kan endast ljuset som sänds ut av punkter på fokalplanet passera genom utgångsnålshålet, medan ljuset som sänds ut av punkter utanför fokalplanet defokuseras på utgångsnålshålsplanet, och de flesta av dem kan inte passera genom det centrala hålet. Därför verkar observationsmålpunkten på fokalplanet ljus, och icke-observationspunkten ser svart ut som bakgrund, vilket ökar kontrasten och rensar bilden. Under bildbehandlingsprocessen är de två nålhålen konfokala, konfokalpunkten är den detekterade punkten och planet där den detekterade punkten är belägen är det konfokala planet.
Storleken på nålhålet vid detektorn i konfokalmikroskopi spelar en avgörande roll. Det påverkar direkt systemets upplösning och signal-brusförhållande. Om nålhålet är för stort kommer den konfokala detekteringseffekten inte att uppnås, vilket inte bara minskar systemets upplösning, utan också introducerar mer ströljus; om nålhålet är för litet kommer det att minska detekteringseffektiviteten och minska den mikroskopiska bilden. ljusstyrka. Studier har visat att när diametern på nålhålet är lika med diametern på Airy-skivan uppfylls de konfokala kraven och detektionseffektiviteten minskar inte nämnvärt. Eftersom diametern på nålhålet i allmänhet är i storleksordningen mikron, om det finns en avvikelse mellan laserstrålens fokuspunkt och nålhålets position, kommer signalförvrängning att uppstå. Därför använder konfokalmikroskop i allmänhet ett autofokussystem, vilket praktiskt taget ökar mättiden.
Eftersom det konfokala lasermikroskopet är en punktavbildning är det nödvändigt att använda tvådimensionell skanning i x- och y-riktningarna för att få en tvådimensionell bild av objektet. Olika mikroskop använder olika skanningsmetoder:
(1) Objektskanning. Det vill säga att objektet i sig rör sig enligt en viss lag, medan ljusstrålen förblir oförändrad. Fördelar: stabil optisk väg; Nackdelar: ett stort skanningsbord krävs, så skanningshastigheten är mycket begränsad.
(2) Ett strålavsökningssystem bildas genom att använda en reflekterande galvanometer. Det vill säga, genom att styra skanningsgalvanometern reflekteras den fokuserade ljuspunkten regelbundet till ett visst lager av objektet för att slutföra tvådimensionell skanning. Dess fördel är att den har hög precision och används ofta för högprecisionsmätning. Skanningshastigheten har förbättrats jämfört med objektskanning, men den är fortfarande inte snabb.
(3) Använd det akusto-optiska avböjningselementet för skanning, och skanningen realiseras genom att ändra ljudvågens utfrekvens och sedan ändra ljusvågens transmissionsriktning. Dess enastående fördel är att skanningshastigheten är mycket snabb. Skanningssystemet som utvecklats av USA använder en akusto-optisk deflektor för att generera videobilder i realtid. Det tar bara 1/30s att skanna en tvådimensionell bild, och den uppnår nästan realtidsutdata.
(4) Nipkow diskskanning. Skanningsprocessen slutförs genom att rotera Nipkow-skivan medan andra komponenter hålls stilla. Det kan avbildas på en gång och hastigheten är mycket hög. Men eftersom avbildningsstrålen är off-axelljus måste linsens off-axel aberration korrigeras och utnyttjandegraden av ljusenergi är mycket låg.
