Att tänja på gränserna för superupplösningsmikroskopi: självinställande mikroskopi
Ultraprecisionsmikroskopi som går utöver begränsningarna för det Nobelprisbelönta superupplösningsmikroskopet kommer att tillåta forskare att direkt mäta avstånden mellan enskilda molekyler.
Medicinska forskare vid University of New South Wales har uppnått oöverträffad upplösning i enmolekylmikroskopi för att upptäcka interaktioner mellan enskilda molekyler i intakta celler.
2014 års Nobelpris i kemi delades ut för utvecklingen av superupplöst fluorescensmikroskopiteknik, som gav mikroskopister den första molekylära bilden av insidan av en cell, en funktion som ger nya molekylära vyer av komplexa biologiska system och processer.
Nu har detektionsgränserna för enmolekylsmikroskopi skjutits upp igen, och detaljer har publicerats i det senaste numret av Science Advances.
Det har varit möjligt att observera och spåra enskilda molekyler med ultrahögupplösta mikroskop, men interaktionerna mellan dessa molekyler sker i en skala som är minst fyra gånger mindre än den som löses upp av befintliga enmolekylära mikroskop.
"Anledningen till att enmolekylmikroskop vanligtvis har en lokaliseringsnoggrannhet runt 20 till 30 nanometer beror vanligtvis på att mikroskopet faktiskt rör sig när det detekterar signaler. Detta leder till osäkerhet. Med hjälp av befintliga superupplösningsinstrument kan vi misslyckas med att avgöra om ett protein är bundet till en annan eftersom avståndet mellan dem är kortare än osäkerheten i deras positioner."
För att lösa detta problem byggde teamet en automatiserad återkopplingsslinga inuti enkelmolekylmikroskopet som upptäcker och justerar om den optiska vägen och spegelstadiet.
"Det spelar ingen roll vad du gör med det här mikroskopet, det hittar i princip returvägen med nanometerprecision. Det är ett smart mikroskop. Det kan göra allt som en operatör eller servicetekniker behöver göra och det kan göra det 12 gånger i sekunden. " sa professor Goss.
Mätning av avståndet mellan proteiner
Med den design och metodik som beskrivs i detta dokument har UNSW-teamet designat ett återkopplingssystem som är kompatibelt med befintliga mikroskop och ger maximal flexibilitet för provberedning.
"Detta är en mycket enkel och elegant lösning på ett stort bildproblem. Vi byggde precis ett mikroskop inuti ett mikroskop och allt vi gjorde var att rikta in huvudmikroskopet. Enkelheten och praktiska lösningen vi hittade är dess verkliga styrka. Det är lätt att klona systemet och anta ny teknik snabbt." sa professor Goss.
För att demonstrera användbarheten av dess ultraexakta återkopplings-enkelmolekylmikroskop använde forskarna det för att göra direkta avståndsmätningar mellan signalproteiner i T-celler. Ett vanligt antagande inom cellulär immunologi är att dessa immunceller förblir vilande när T-cellsreceptorn är nära en annan molekyl som fungerar som en broms.
Deras högprecisionsmikroskopi kunde visa att de två signalmolekylerna faktiskt var ytterligare separerade från varandra i aktiverade T-celler, vilket släppte bromsen och aktiverade T-cellsreceptorsignalering.
Prof. Goss sa: "Konventionella mikroskopitekniker skulle inte kunna mäta en så liten förändring exakt eftersom avståndet mellan dessa signalmolekyler i vilande och aktiverade T-celler skiljer sig endast med 4-7 nanometer."
"Detta visar också hur känsliga dessa signalmekanismer är för rumslig isolering. För att identifiera sådana regleringsprocesser behöver vi utföra exakta avståndsmätningar, vilket är vad det här mikroskopet möjliggör. Dessa resultat illustrerar att tekniken är under upptäckt och inte kan tillverkas i någon annat sätt."
