Provberedningskrav för fluorescensmikroskopi
Krav för beredning av prov för fluorescensmikroskopi
(1) Glasskiva
Skjutglasets tjocklek ska vara mellan 0.8-L2 mm. Ett objektglas som är för tjockt absorberar mer ljus å ena sidan och kan å andra sidan inte fokusera excitationsljuset på provet. Objektglasen måste vara släta, enhetliga i tjocklek och fria från uppenbar autofluorescens. Ibland används kvartsglas.
(2) Täckglas
Tjockleken på täckglaset är cirka 0.17 mm, slät. För att stärka excitationsljuset kan man även använda ett interferentäckglas, vilket är ett speciellt täckglas belagt med flera lager av ämnen (som magnesiumfluorid) som har olika störeffekter på ljus av olika våglängder, vilket kan göra att fluorescens slät. Excitationsljus passerar igenom och excitationsljuset reflekteras, och detta reflekterade excitationsljus kan excitera provet.
(3) Prov
Vävnadsskivor eller andra prover bör inte vara för tjocka. Om tjockleken är för tjock kommer det mesta av excitationsljuset att förbrukas i den nedre delen av provet, medan den övre delen som direkt observeras av objektivlinsen inte kan exciteras helt. Dessutom påverkar fluorescens orsakad av överlappande celler eller föroreningar, bakgrundsfärgning av ospecifik färg bedömningen.
(4) spegelolja
I allmänhet, när man observerar prover med mörkfältsfluorescensmikroskop och oljeimmersionsmikroskop, måste immersionsolja användas. Det är bäst att använda speciell icke-fluorescerande immersionsolja. Glycerin kan också användas istället, och flytande paraffin kan också användas, men brytningsindexet är lågt, vilket har en liten inverkan på bildkvaliteten.
Förstå ljuskuben av fluorescensmikroskopi
Fluorescens är det ljus som elektroner i ett ämne absorberar ljusenergi från ett lågenergitillstånd till ett högenergitillstånd, och sedan släpper ut ljus när det återgår till ett lågenergitillstånd. Det är icke-temperaturutstrålat ljus - luminescens. Det vill säga: ämnet absorberar kortvågigt ljus, går in i ett exciterat tillstånd och avger långvågigt ljus.
Oavsett om det är ämnets autofluorescens, det fluorescerande färgämnet eller det fluorescerande proteinet som uttrycks genom fusion, måste det exciteras av en specifik ljusvåglängd (excitation). Efter att elektronerna migrerar och förlorar energi, avger de ljus med en specifik lång våglängd (emission). , som kan samlas in av detektionssystemet för att uppnå funktionen att identifiera specifik fluorescens.
Vad är en fluorescerande ljuskub?
I fluorescensmikroskopobservation och avbildning tillhandahålls excitationsljuset med specifik våglängd och motsvarande långvåglängds emissionsljus av fluorescensljuskuben, så att fluorescenssignalen kan samlas in av blotta ögat, bildskärmen eller kameran. Därför bestämmer fluorescensljuskuben vad som kan detekteras. Nyckelanordningen för fluorescenssignalen, dess egenskaper inkluderar EX: excitationsvåglängdsfilterparametrar, EM: emissionsvåglängdsfilterparametrar och DM: dikotoma spegelparametrar. Ta DAPI-ljuskuben från Revolve integrerade fluorescensmikroskop som ett exempel, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm ljus kan överföras till EM; EM-emissionsfilter används för att separera fluorescensen som emitteras av fluoroforen från andra optiska bakgrundselement för att separera ljus. Emissionsfilter sänder ljus vid fluorescensvåglängden genom den dikroiska spegeln samtidigt som de blockerar allt annat ljus som läcker från excitationsljuskällan (reflekteras från provet eller optiken). Den emitterade ljusvåglängden är större än EM som ska observeras, det vill säga endast ljus inom området 450±25nm kommer in i detektionssystemet. Korrekt val av EX-, EM-filter och DM-dikotomier kan hjälpa forskare att uppnå högre signal-brus-förhållanden (S/N).
