Färgningstekniker och mikroskopisk observation av mikroorganismer
1. Syfte
1.1 Lär dig de grundläggande teknikerna för mikrobiella utstryk och färgning.
1.2 Bemästra den enkla färgningsmetoden för bakterier.
1.3 Preliminärt förstå de morfologiska egenskaperna hos bakterier och konsolidera kunskapen om hur man använder oljelinser och aseptiska operationstekniker.
2 Principer
Smörjning och färgning av bakterier är en grundläggande teknik i mikrobiologiska experiment. Bakterieceller är små och genomskinliga, vilket gör dem svåra att identifiera under ett vanligt ljusmikroskop; de måste vara färgade. Ett enda färgämne används för att färga bakterier, så att de färgade bakterierna bildar en tydlig färgskillnad från bakgrunden, så att deras morfologi och struktur kan observeras tydligare. Denna metod är lätt att använda och lämpar sig för att observera den allmänna formen av bakterieceller och arrangemanget av bakterier. Grundfärger används vanligtvis för enkel färgning. Detta beror på att i neutrala, alkaliska eller svagt sura lösningar är bakterieceller vanligtvis negativt laddade, och när basiska färgämnen joniseras är den färgande delen av deras molekyler positivt laddade, så de är alkaliska. Den färgande delen av färgämnet kombineras lätt med bakterier för att färga dem. De färgade bakteriecellerna kontrasterar skarpt mot bakgrunden, vilket gör dem lättare att identifiera under ett mikroskop. Färgämnen som vanligtvis används för enkel färgning inkluderar metylenblått, kristallviolett, basiskt fuchsin, etc. När bakterier bryter ner socker och producerar syra, vilket gör att odlingsmediets pH sjunker, ökar den positiva laddningen på bakterierna. Vid denna tidpunkt kan sura färgämnen som eosin, surt fuchsin eller Kongorött användas för färgning. Bakterier måste fixeras innan färgning. Det har två syften: det ena är att döda bakterier och få dem att fästa vid glasskivan; den andra är att öka deras affinitet för färgämnen. Två vanliga metoder är uppvärmning och kemisk fixering. Vid fixering, försök att behålla den ursprungliga formen på cellerna.
3 material
3.1 Bakterier: Bacillus subtilis 12-18h näringsagar lutande kultur, Staphylococcus aureus 24h näringsagar slant kultur, Escherichia coli 24h näringsagar slant kultur, bagerijästagar lutande kultur.
3.2 Färgmedel: Lus alkaliska metylenblått färgämne (eller ammoniumoxalat kristallviolett färgämne), karbolsyrafuchsinfärgämne.
3.3 Instrument eller andra redskap: mikroskop, alkohollampa, objektglas, inokulationsögla, objektglasställ, flaska med dubbla lager (innehållande cederträolja och xylen), linsvävnad, fysiologisk saltlösning eller destillerat vatten, etc.
4. Process: smeta → torkning → fixering → färgning → tvätt → torkning → mikroskopisk undersökning.
5 steg
5.1 Smörj: Ta två rena och oljefria objektglas. Under sterila förhållanden, häll en liten droppe normal koksaltlösning (eller destillerat vatten) på varje mitt på objektglaset. Använd en ympslinga för att sterilisera bakterierna från Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus och Escherichia coli, plocka en liten bakteriegräsmatta i vattendropparna på lutningen, blanda väl och applicera till en tunn film. Om du använder en bakteriesuspension (eller flytande odling) utstryk, kan du använda en inokuleringsögla för att plocka 2 till 3 öglor och applicera dem direkt på objektglaset. Var noga med att inte tappa för mycket fysiologisk saltlösning (destillerat vatten) och ta bort bakterier och applicera det jämnt och inte för tjockt.
5.2 Torkning Torka naturligt i rumstemperatur. Du kan också värma den något över en alkohollampa med den belagda sidan uppåt för att torka den. Men se till att inte komma för nära lågan, eftersom för hög temperatur kommer att förstöra bakteriernas morfologi.
5.3 Fixering Om upphettad torkning används kombineras fixering och torkning i ett steg, och metoden är densamma som torkning. Smörj ut, torka och värmefixera.
5.4 Färgning: Placera objektglaset plant på objektglasstället och tillsätt 1 till 2 droppar färglösning på utstryket (det är lämpligt att färglösningen precis täcker utsmetningsfilmen). Färga med Lus basiska metylenblått i 1 till 2 minuter och färga med karbolsyrafuchsin (eller ammoniumoxalatkristallviolett) i cirka 1 minut.
5.5 Tvätta med vatten: Häll av färglösningen och skölj försiktigt med kranvatten från ena änden av objektglaset tills vattnet som rinner ner från smeten är färglöst. Vid tvätt med vatten, tvätta inte den belagda ytan direkt med vatten. Vattenflödet bör inte vara för snabbt eller för stort för att förhindra att utsmetningsfilmen faller av.
5.6 Torkning: Skaka av vattendropparna på objektglaset och torka naturligt, föna med en hårtork eller absorbera det med absorberande papper (var noga med att inte torka bort bakterierna). 5.7 Mikroskopisk undersökning Efter att utstryket är torrt, utför en mikroskopisk undersökning. Utstryket måste vara helt torrt innan du tittar med en oljelins.
6 Resultat Rita morfologin för E. coli och Micrococcus luteus som observerats efter enstaka färgning.
