Den huvudsakliga observationsmetoden för optiskt mikroskop är fluorescensobservation
Fluorescens avser den process där ett fluorescerande ämne avger ljus med en längre våglängd nästan samtidigt när det bestrålas med ljus av en specifik våglängd (Figur 1). När ljus med en specifik våglängd (excitationsvåglängd) träffar en molekyl, såsom de i en fluorofor, absorberas fotonenergin av molekylens elektroner. Därefter övergår elektronerna från grundtillståndet (S0) till en högre energinivå, det exciterade tillståndet (S1'). Denna process kallas excitation①. Elektronen förblir i exciterat tillstånd i 10-9–10-8 sekunder, under vilket elektronen förlorar lite energi②. Under processen för elektroner som lämnar det exciterade tillståndet (S1) och återgår till grundtillståndet③, frigörs den återstående energin som absorberas under excitationsprocessen.
Uppehållstiden för den fluorescerande molekylen i det exciterade tillståndet är fluorescenslivslängden, som vanligtvis är på nanosekundnivån, och är en inneboende egenskap hos själva fluorescensmolekylen. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), som använder fluorescence lifetime imaging-teknik, kallas fluorescence lifetime imaging (FLIM). Förutom fluorescensintensitetsavbildning kan mer djupgående funktionella och exakta mätningar erhållas för att erhålla molekylär konformation, intermolekylära interaktioner och molekylernas mikromiljö. Information som är svår att få fram med konventionell optisk bildbehandling.
En annan viktig egenskap hos fluorescens är Stokes-skiftet, skillnaden i våglängd mellan excitations- och emissionstopparna (Figur 2). Vanligtvis är emissionsvåglängden längre än excitationsvåglängden. Detta beror på att elektroner kommer att förlora en del av sin energi genom avslappningsprocessen efter att det fluorescerande ämnet exciteras och innan fotoner frisätts. Fluorescerande ämnen med större Stokes-skift är lättare att observera under ett fluorescensmikroskop.
Fluorescensmikroskopi och fluorescensfilterkuber
Fluorescensmikroskop är ett optiskt mikroskop som använder fluorescensegenskaper för observation och avbildning, och används i stor utsträckning inom olika områden som cellbiologi, neurobiologi, botanik, mikrobiologi, patologi och genetik. Fluorescensavbildning har fördelarna med hög känslighet och hög specificitet, och är mycket lämplig för observation av fördelningen av specifika proteiner och organeller i vävnader och celler, studiet av kolokalisering och interaktion, spårning av livsdynamiska processer såsom förändringar i jonkoncentrationen , etc.
De flesta molekyler i celler fluorescerar inte, och för att se dem måste de vara fluorescerande märkta. Det finns många metoder för fluorescerande märkning, såsom direkt märkning (som att använda DAPI för att märka DNA), eller immunfärgning med användning av antikroppars antigenbindande egenskaper, eller användning av fluorescerande proteiner (som GFP, grönt fluorescerande protein) för att märka målproteiner , och vändbar bindning. Syntetiska färgämnen (som Fura-2) och så vidare.
För närvarande har fluorescensmikroskopet blivit standardbildutrustningen för olika laboratorier och bildplattformar och är en bra hjälpreda för våra dagliga experiment. Fluorescensmikroskop är huvudsakligen indelade i tre kategorier: upprättstående fluorescensmikroskop (lämpliga för skivning), inverterade fluorescensmikroskop (lämpliga för levande celler, med hänsyn till skivning), fluorescerande stereoskop (lämpliga för större exemplar, såsom växter, zebrafiskar (vuxen/embryo) ), medaka, mus/råtta organ, etc.).
Fluorescensfilterblock är kärnkomponenten i mikroskopfluorescensavbildning. Den består av tre delar: excitationsfilter, emissionsfilter och dikroisk stråldelare. Den är installerad i filterhjulet. Till exempel är Leica DMi8 utrustad med ett 6-positionsfilterhjul (Fig. 3). Antalet positioner för olika mikroskophjul kommer att vara olika, och vissa mikroskop använder filterblocksglas.
Filterblocket spelar en viktig roll vid fluorescensavbildning: excitationsfiltret väljer excitationsljuset för att excitera provet och blockerar ljus med andra våglängder; ljuset som passerar genom excitationsfiltret passerar genom den dikroiska spegeln (dess funktion är att reflektera excitationsljuset och överföra fluorescensen), Efter reflektion fokuseras det av objektivlinsen, bestrålar provet och exciterar motsvarande fluorescens, dvs. , utsänt ljus. Det emitterade ljuset samlas upp av objektivlinsen, passerar genom den dikroiska stråldelaren och når emissionsfiltret. Som visas i figur 4: excitationsvåglängden är 450-490nm, den dikroiska spegeln reflekterar ljus kortare än 510nm, sänder ljus längre än 510nm och mottagningsområdet för emitterat ljus är 520-560nm.
