Två-foton fluorescensmikroskopi har många fördelar:
1) Längre ljusvåglängder påverkas mindre av spridning än kortare ljusvåglängder för att penetrera provet;
(2) Fluorescerande molekyler utanför fokalplanet exciteras inte så att mer excitationsljus kan nå fokalplanet, så att excitationsljuset kan penetrera djupare in i provet;
3) Längre våglängder av nära-infrarött ljus är mindre giftiga för celler än kortare våglängder;
4) När ett tvåfotonmikroskop används för att observera ett prov, är fotoblekning och fototoxicitet endast närvarande i fokalplanet. Därför är tvåfotonmikroskop mer lämpade än enkelfotonmikroskop för att observera tjocka prover, för att observera levande celler eller för att utföra fläckexperiment med fotoblekning.
Kunskap om konfokal fluorescensmikroskop
Grundprincipen för konfokalt fluorescensmikroskop: en punktljuskälla används för att bestråla provet och bildar en liten, väldefinierad ljuspunkt på fokalplanet. Fluorescensen som emitteras från denna punkt efter bestrålning samlas upp av objektivlinsen och skickas tillbaka till stråldelaren som består av en dubbelriktad kromatisk spegel längs den ursprungliga strålningsljusbanan. Stråldelaren skickar fluorescensen direkt till detektorn. Både ljuskällan och detektorn har vardera ett nålhål framför sig, kallat belysningspinhålet respektive detektionsnålhålet. Båda har samma geometri, ungefär 100-200 nm, och är konjugerade med avseende på ljuspunkten på fokalplanet, dvs. ljuspunkten passerar genom en serie linser och kan i slutändan fokuseras på både den belysande och detektornålshål. På detta sätt kan ljus från fokalplanet konvergera inuti sondens öppning, medan spritt ljus ovanifrån eller under fokalplanet blockeras utanför sondens öppning och inte kan avbildas. Lasern skannar provet punkt för punkt, och fotomultiplikatorröret efter detektering av pinhole erhåller också den konfokala bilden av motsvarande ljus punkt för punkt, som omvandlas till en digital signal och överförs till datorn, och slutligen konvergerar till en klar konfokal bild av hela fokalplanet på skärmen.
Varje fokalplansbild är faktiskt ett optiskt tvärsnitt av provet, och detta optiska tvärsnitt har alltid en viss tjocklek, även känt som ett optiskt ark. Eftersom ljusintensiteten vid brännpunkten är mycket större än den vid icke-brännpunkten, och ljuset i icke-brännplanet filtreras bort av nålhålet, uppskattas skärpedjupet för det konfokala systemet vara noll, och skanning längs Z-axelns riktning gör det möjligt för optisk tomografi att bilda en tvådimensionell optisk skiva av provet som ska observeras vid brännpunkten. Genom att kombinera XY-plan (fokalplan) skanning med Z-axel (optisk axel) skanning, kan en tredimensionell bild av provet erhållas genom att ackumulera successiva lager av tvådimensionella bilder, som bearbetas av specialiserad datorprogramvara.
Detta innebär att detektionsnålhålet och ljuskällans nålhål alltid är fokuserade på samma punkt, så att fluorescens exciterad utanför fokalplanet inte kan komma in i detektionsnålhålet.
Arbetsprincipen för laserkonfokal är helt enkelt uttryckt att den använder laser som ljuskälla, på basis av traditionell fluorescensmikroskopavbildning, ytterligare laserskanningsanordning och konjugerad fokuseringsanordning, genom datorstyrning för att utföra digitalt bildinsamling och bearbetningssystem.
