Vad är två-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för tvåfotonexcitation är: vid hög fotondensitet kan fluorescerande molekyler absorbera två långvågiga fotoner samtidigt och emittera en foton med kortare våglängd efter en kort period av så kallat exciterat tillståndslivslängd . ; effekten är densamma som att använda en foton vars våglängd är halva den långa våglängden för att excitera en fluorescerande molekyl. Två-fotonexcitation kräver en hög fotondensitet. För att inte skada celler använder tvåfotonmikroskopi högenergilägeslåsta pulsade lasrar. Lasern som emitteras av denna laser har hög toppenergi och låg medelenergi, dess pulsbredd är bara 100 femtosekunder och dess frekvens kan nå 80 till 100 megahertz. När man använder en objektivlins med hög numerisk bländare för att fokusera fotonerna i den pulsade lasern, är fotondensiteten vid objektivlinsens brännpunkt högst, och exciteringen av två foton sker endast vid objektivlinsens brännpunkt, så tvåfotonmikroskopet behöver inte ett konfokalt nålhål, vilket förbättrar effektiviteten för fluorescensdetektion.
I allmänna fluorescensfenomen, på grund av den låga fotondensiteten hos excitationsljuset, kan en fluorescerande molekyl bara absorbera en foton samtidigt och sedan avge en fluorescerande foton genom en strålningsövergång, vilket är enkelfotonfluorescens. För fluorescensexcitationsprocessen med laser som ljuskälla kan tvåfoton eller till och med multifotonfluorescens förekomma. Vid denna tidpunkt är intensiteten hos den använda excitationsljuskällan hög, och fotondensiteten uppfyller kraven för fluorescerande molekyler som absorberar två fotoner samtidigt. I processen att använda en allmän laser som excitationsljuskälla är fotondensiteten fortfarande inte tillräcklig för att producera tvåfotonabsorptionsfenomenet. Vanligtvis används en femtosekundspulsad laser, och dess momentana effekt kan nå storleksordningen megawatt. Därför är våglängden för två-fotonfluorescens kortare än våglängden för excitationsljus, vilket är ekvivalent med effekten som produceras av excitation vid halva excitationsvåglängden.
