En praktisk kunskap om konfokal fluorescensmikroskopi
Grundprincipen för konfokal fluorescensmikroskopi: Använd en punktljuskälla för att belysa provet för att bilda en liten, väldefinierad ljusfläck på fokalplanet. Fluorescensen som emitteras av fläcken efter att ha blivit belyst samlas upp av objektivlinsen och återförs till den dikroiska spegeln längs den ursprungliga belysningsljusbanan. utgöra en stråldelare. Spektrometern skickar fluorescensen direkt till detektorn. Det finns ett nålhål framför ljuskällan och detektorn, som kallas belysningshålet respektive detektionshålet. De geometriska dimensionerna för de två är konsekventa, ungefär 100-200nm; i förhållande till ljuspunkten på fokalplanet är de två konjugerade, det vill säga ljuspunkten passerar genom en serie linser och kan i slutändan fokuseras på belysningsnålhålet och detektionsnålhålet samtidigt. På detta sätt kan ljuset från fokalplanet koncentreras inom detektionshålets räckvidd, medan det spridda ljuset från ovan eller under fokalplanet blockeras utanför detektionshålet och inte kan avbildas. Provet skannas punkt för punkt med lasern, och fotomultiplikatorröret bakom detektionsnålhålet erhåller också den konfokala bilden av motsvarande ljus punkt för punkt, som omvandlas till en digital signal och överförs till datorn och slutligen aggregeras på skärmen till en tydlig konfokal bild av hela fokalplanet. .
Varje fokalplansbild är faktiskt ett optiskt tvärsnitt av provet. Detta optiska tvärsnitt har alltid en viss tjocklek och kallas även för en optisk tunn sektion. Eftersom ljusintensiteten vid fokus är mycket större än ljusintensiteten vid icke-fokus, och ljuset i icke-fokalplanet filtreras av nålhålet, är skärpedjupet för det konfokala systemet ungefär noll. Scanning längs Z-axelns riktning kan realisera optisk tomografi, vilket bildar den önskade. Observera den tvådimensionella optiska sektionen vid den fokuserade platsen av provet. Genom att kombinera XY-plan (fokalplan) skanning med Z-axel (optisk axel) skanning, genom att ackumulera kontinuerliga nivåer av tvådimensionella bilder och bearbeta dem med specialiserad datormjukvara, kan en tredimensionell bild av provet erhållas.
Det vill säga, detektionsnålhålet och ljuskällans hål är alltid fokuserade på samma punkt, så att fluorescensen som exciteras utanför fokusplanet inte kan komma in i detektionsnålhålet.
Det enkla uttrycket för arbetsprincipen för laserkonfokal är att den använder laser som ljuskälla. På basis av traditionell fluorescensmikroskopavbildning läggs en laserskanningsanordning och en konjugatfokuseringsanordning till, och systemet styrs av en dator för att samla in och bearbeta digitala bilder.
