Bestämning av antalet mikroorganismer - mikroskopets direkträkningsmetod!
Bakteriell populationstillväxt manifesteras av en ökning av cellantal eller en ökning av cellmassa. Metoderna för att bestämma antalet celler inkluderar direktmikroskopräkningsmetod, plattkoloniräkningsmetod, fotoelektrisk oljeförhållandemetod, maximal sannolikhetsmetod och membranfiltreringsmetod. Metoderna för att mäta cellmaterial inkluderar bestämning av celltorrvikt, bestämning av vissa cellulära komponenter såsom kväve-, RNA- och DNA-innehåll och bestämning av metaboliter. Kort sagt, det finns många metoder för att mäta tillväxten av mikroorganismer, var och en med sina egna fördelar och nackdelar, och bör väljas efter den specifika situationen. Detta experiment introducerar huvudsakligen mikroskopets direkträkningsmetod som vanligtvis används i produktion och vetenskaplig forskning.
1. Syfteskrav
1. Förtydliga principen för blodcellsräkning.
2. Bemästra metoden att räkna mikroorganismer med hjälp av en blodkroppsräknare.
2. Grundläggande principer
Mikroskop direkträkningsmetod är en enkel, snabb och intuitiv metod för att direkt räkna en liten mängd suspension av provet som ska testas på ett speciellt objektglas med en viss yta och volym (även känd som en bakterieräknare). Metoder. För närvarande är de vanligaste bakterieräknare hemma och utomlands: blodcellsräknare, Peteroff-Hauser bakterieräknare och Hawksley bakterieräknare etc. De kan användas för räkning av jäst, bakterier, mögelsporer och andra suspensioner, och grundprincipen är densamma. De två sistnämnda typerna av bakterieräknare har en total volym på 0.02 mm3 efter att ha täckts med ett täckglas, och avståndet mellan täckglaset och objektglaset är bara 0,02 mm, så oljan nedsänkningsobjektiv kan användas för att observera och observera små celler som bakterier. räkna. Utöver dessa bakteriometrar finns det även en uppskattningsmetod för förhållandet mellan arean av utstryket och arean av synfältet som observeras direkt under mikroskopet, som vanligtvis används för bakteriologisk undersökning av mjölk. Fördelarna med direkträkningsmetoden i mikroskop är intuitiv, snabb och enkel att använda. Nackdelen med denna metod är dock att det uppmätta resultatet vanligtvis är summan av döda och levande celler. För närvarande finns det några metoder för att övervinna denna brist, såsom kombinationen av livsdugliga bakterier som färgar mikrokammarkultur (kort tid) och tillägg av celldelningshämmare för att uppnå syftet att endast räkna livsdugliga bakterier.
I detta experiment användes en hemocytometer som ett exempel för direkt mikroskopisk räkning. För användning av de andra två typerna av bakterieräknare, se instruktionerna från respektive tillverkare. Att räkna direkt under mikroskopet med en hemocytometer är en vanlig metod för att räkna mikroorganismer. Räkneplattan är en speciell glasrutschbana, på vilken tre plattformar bildas av fyra slitsar; den bredare plattformen i mitten är uppdelad i två halvor av en kort tvärgående slits, och det finns ett galler på varje sida av plattformen. Varje rutnät är uppdelat i nio stora rutor, och den stora fyrkanten i mitten är räknerummet. Strukturen på blodkroppsräkneplattan visas i figur l{{{{10}}}}. Räknerummets skala har i allmänhet två specifikationer, den ena är en stor ruta uppdelad i 25 mittersta rutor, och varje mellanruta är uppdelad i 16 små rutor (Figur 15-2); den andra är ett stort torg. Rutan är uppdelad i 16 mittersta rutor, och varje mellanruta är uppdelad i 25 små rutor, men oavsett vilken typ av räknebräde det är så finns det 400 små rutor i varje stor ruta. Sidlängden på varje stor kvadrat är 1 mm och arean på varje stor kvadrat är 1 mm2. Efter täckning med täckglas är höjden mellan täckglaset och objektglaset 0,1 mm, så volymen på räknekammaren är 0,1 mm3 (en tusendels milliliter). Figur 15-1 Strukturen av blodcellsräkningstavlan (1) Figur 15-2 Strukturen av blodcellsräkningstavlan (2) A. Framifrån; B. Longitudinell snittvy; Det förstorade rutnätet, den stora kvadraten i mitten är räknekammaren 1. Blodkroppar Räkneplatta; 2. Täckglas; 3. När du räknar i räknekammaren, räkna vanligtvis det totala antalet bakterier i fem rutor, beräkna sedan medelvärdet av varje kvadrat och multiplicera med 25 eller 16 för att få Det totala antalet bakterier i en stor kvadrat omvandlas sedan till totalt antal bakterier i 1 ml bakterielösning. Låt det totala antalet bakterier i de fem kvadraterna vara A och utspädningsförhållandet för bakterielösningen till B. Om det är en räkneplatta med 25 rutor, är det totala antalet bakterier i 1 ml bakterielösning {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(bitar) På liknande sätt, om det är en räkneplatta med 16 medelstora kvadrater, det totala antalet bakterier i 1mL bakterielösning=A/ 5×16×104×B=32000A·B (bitar)
3. Utrustning
1. Bakterier
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrument eller andra redskap
Hemocytometer, mikroskop, täckglas, steril kapillärdroppare.
4. Driftsteg
1. Beredning av bakteriesuspension
Saccharomyces cerevisiae bereddes till en bakteriesuspension med lämplig koncentration med steril fysiologisk saltlösning.
2. Mikroskopräkningsrum
Innan du lägger till prover, inspektera mikroskopiskt räknekammaren på räkneplattan. Om det finns smuts måste det rengöras och torkas innan räkning.
3. Lägg till prov
Täck den rena och torra hemocytometern med ett täckglas och använd sedan en steril kapillärdroppare för att släppa en liten droppe av den skakade Saccharomyces cerevisiae-suspensionen från kanten av täckglaset och låt bakterielösningen automatiskt röra sig längs gapet genom kapillärosmos. När man går in i räknerummet kan det allmänna räknerummet fyllas med bakterievätska. Vid provtagning, skaka först bakterielösningen; vid tillsättning av prover bör inga luftbubblor genereras i räknekammaren.
4. Mikroskopräkning
Efter att ha tillsatt provet, stå stilla i 5 minuter, placera sedan hemocytometern på mikroskopet, hitta först platsen för räknekammaren med ett lågeffektmikroskop och byt sedan till ett högeffektmikroskop för räkning. Justera intensiteten på mikroskopljuset på lämpligt sätt. För mikroskop som använder speglar för belysning, var uppmärksam på att inte avvika från ena sidan av ljuset, annars blir det inte lätt att se de fyrkantiga linjerna i räknerummet tydligt i synfältet, eller bara vertikala linjer eller horisontella linjer kommer att bli sedd. Om det visar sig att bakterielösningen är för koncentrerad eller för utspädd före räkning, är det nödvändigt att justera spädningen innan räkning. I allmänhet kräver provspädningen cirka 5 till 10 bakterier i varje liten cell. Varje räknekammare väljer 5 mittceller (valfritt 4 hörn och en mittcell i mitten) för räkning. Cellerna på rutnätslinjen räknas i allmänhet endast på de övre och högra linjerna. När det gäller jästknoppning, när knoppens storlek når hälften av modercellen, räknas den som två bakterieceller. För att räkna ett prov, beräkna bakterieinnehållet i provet genom att beräkna medelvärdet från de två räknekamrarna.
5. Tvätta blodkroppstalet
Efter användning, skölj blodcellsräkningsbrädan med vatten i kranen, skrubba inte med hårda föremål och torka den själv eller med en hårtork efter tvätt. Mikroskopisk undersökning för att observera om det finns kvarvarande bakterier eller andra sediment i varje liten cell. Om den inte är ren måste den tvättas flera gånger tills den är ren.
