Hur mycket vet du om fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskop använder i allmänhet högintensiva kvicksilverlampor som excitationsljuskällor. Filter används för att filtrera bort oönskat ljus och lämnar bara det högintensiva, rena ljuset som exciterar fluoroforen. Efter att det monokromatiska ljuset bestrålar provet genom objektivlinsen, kommer provet att exciteras för att emittera ljus (fluorescens), och både fluorescensen och excitationsljuset kommer att återvända längs objektivlinsens optiska bana. I detta fall krävs en dikroisk spegel för att filtrera excitationsljuset. , låter bara den fluorescens vi behöver se igenom.
Denna fluorescens når okularet längs mikroskopets ljusbana och kommer sedan in i våra ögon, där vi kan se fluorescensen som emitteras av fluoroforen.
Förkontroll och justering av fluorescensmikroskopet:
(1) Före varje fluorescensobservation är det nödvändigt att rutinmässigt kontrollera filamentinriktningen, optisk vägfokus, bländare och fältbländarinställningar för fluorescensanordningen.
(2) Om den erforderliga fluorescensexcitations-/emissionsfilterenheten har installerats i omvandlaren, om fluorescensmikroskopets objektivlins är korrekt konfigurerad, och ta bort oljefläckarna och damm på den främre linsen på objektivlinsen.
(3) Om faskontrastobservation av transmitterat ljus utförs samtidigt, är det nödvändigt att kontrollera konjugationen av kondensorns centrum och faskontrastringen mittemot objektivlinsen.
(4) Kontrollera om provbäraren (slidglas, täckglas och andra redskap) är täckt med vätska eller damm och om tjockleken ligger inom objektivlinsens kalibrerade arbetsavståndsområde. Det skivade provet bör inte vara för tjockt, helst mindre än eller lika med 10 μm.
(5) Eftersom ljuskällan innehåller ultravioletta strålar, placeras en brun ljusskärmande platta ovanför scenens framsida för att förhindra att ultravioletta strålar skadar näthinnan.
(6) Spänningsinstabilitet kommer att minska livslängden för högtryckskvicksilverlampan, och ljuskällans strömförsörjning är utrustad med en spänningsstabilisator.
(7) För att förlänga livslängden på kvicksilverlampan kan den stängas av 15 minuter efter att den har slagits på; när kvicksilverlampans lysrör är avstängd måste den vänta minst 10 minuter för att återstarta kvicksilverångan för att svalna och återgå till det ursprungliga tillståndet, annars kommer lampans livslängd att påverkas.
Bildobservation med fluorescensmikroskop:
(1) Cirka 5-10 minuter efter att den fluorescerande ljuskällan har slagits på tenderar intensiteten hos excitationsljuset att vara stabil och provet laddas för observation; för att förhindra fluorescenssläckning av provet orsakad av överdrivet excitationsljus under processen att fokusera och leta efter objekt, zooma först ut fluorescensmikroskopet. Justera excitationsljuset till en måttlig intensitet med ett bländare eller lägg till ett ND-filter, och flytta provstadiet regelbundet. När du har bekräftat spegelbilden, justera till fluorescerande tillstånd för fotografering och inspelning.
(2) Justeringar för dålig bildkvalitet. Förutom provberedningsfaktorer är de nödvändiga justeringarna som kan göras:
① Uteslut ljusavskärmande eller ljusbegränsande enheter i den optiska bildvägen, såsom DIC-tillbehör, ND-filter, etc.
②Justera om mottagarens fokus och bländardiafragmastorleken på fluorescensmikroskopet.
③ Justera försiktigt täckningsskillnadens korrigeringsring på fluorescensmikroskopobjektivet.
Appliceringspunkter för fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopi använder "aktinisk fluorescens" avbildning. Om den valda excitationsvåglängden är i det nära-ultravioletta området (320-400nm), som är osynligt för blotta ögat, är emissionsspektrumet för fluorescens också kortare än medelvåglängden för vanliga ljusspegelljuskällor. förbättra. Högenergifotoner kolliderar med elektroner, vilket gör att elektronerna övergår från grundtillståndet till det exciterade tillståndet. Elektronerna i det exciterade tillståndet är mycket instabila och kommer att falla tillbaka till grundtillståndet. I denna process kommer en del av den termiska energin att förbrukas och nya fotoner kommer att sändas ut. Den nya fotonen har lägre energi än den ursprungliga fotonen och har därför en längre våglängd. Eftersom den nya fotonvåglängden skiljer sig från fotonvåglängden för det infallande ljuset, separeras de två ljusstrålarna med olika våglängder med en viss optisk bearbetningsmetod, så att vi bara ser de emitterade nya fotonerna (fluorescenssignalen), dvs. fluorescensmikroskopet ser fluorescensbilder.
