Laserkonfokalmikroskop funktioner och tillämpningar
Medan i ett normalt mikroskop bildplanet för observationen är isolerat från de angränsande axiella planen genom att överlappa objektivlinsens fokalplan med detektorn, i ett konfokalmikroskop uppnås denna isolering genom att belysa provet med en diffraktionsbegränsad punkt på ljus och filtrering av ströljus genom att använda ett nålhål i vägen för uppsamlat ljus vid det konjugerade fokuset för denna ljuspunkt för att uppnå denna isolering och därmed förbättra upplösningen.
Endast ljuset som reflekteras tillbaka från det konjugerade provlagret kan passera genom hålet i uppsamlingsljusbanan, medan resten av de irrelevanta reflektionerna av provskiktet blockeras av hålet. Detta ger en betydande ökning av upplösningen. Nedan visas en jämförelse sida vid sida av multidimensionell fluorescensmikroskopi och konfokalmikroskopi av samma tjocka prov. När en serie bilder tas i olika fokalplan produceras en bild som vanligtvis kallas en "z-stack", som visar upplösnings- och kontrastförstärkningarna som tillhandahålls av konfokalmikroskopi och de bakomliggande orsakerna till dessa vinster. Det kan ses att en undersökning av bilden överst i stapeln där avbildningsplanet är ovanför vävnaden avslöjar en stor mängd spritt ljus i fluorescensbilden, medan den konfokala mikroskopbilden ser svart ut. Denna minskning av PSF i axiell riktning bidrar direkt till skillnaden i upplösning som observeras vid det optiska gränssnittet i mitten av z-stacken.
Optisk skivavsökning
En annan egenskap hos laserskanningskonfokalmikroskopi är att det är en skanningsteknik. Traditionella bredfältsbelysningstekniker belyser hela provet så att bilden kan fångas direkt med blotta ögat eller en detektor, men LSCM använder en eller flera fokuserade ljusstrålar för att skanna igenom provet, så att den resulterande bilden kallas en optisk skiva, som visas i följande diagram. Skillnaden mellan traditionell bredfältsbelysning och konfokal belysning med laserskanning visas nedan.
Därför visas ett praktiskt sätt för modern konfokalmikroskopi i figuren nedan. Excitationsljuset från lasern passerar genom en dikroisk spegel och skannas genom ett par galvanometerspeglar i x-riktningen och y-riktningen av provet, och excitationen (eller reflektionen) av provet passerar genom ett nålhål in i PMT:n detektorn som ska registreras, och den registrerade skannade bilden rekonstrueras av en dator för att producera en verklig bild av provet.
