Metoder för att utöka fokusdjupet i multifotonmikroskop
Kombinationen av tvåfotonlasermikroskop och kalciumindikator är guldstandarden för in vivo neuronal signaldetektering. Neuronerna i neurala nätverk är fördelade i tredimensionellt utrymme, och övervakning av deras aktivitetsdynamik kräver ett sätt att snabbt förbättra volymavbildningshastigheten. Om man använder ett multifotonmikroskop med raster för att avbilda ett stort antal bilder, om ett objektiv med hög numerisk apertur (NA) används för att uppnå högre lateral upplösning, kommer det att resultera i ett mindre bränndjup. För att erhålla volymavbildning vid ett litet bränndjup,
Det är nödvändigt att utföra Z-axelskanning på något sätt, avbilda många plan genom att skanna varje fokalplan, vilket kraftigt begränsar bildhastigheten. Om axiell bildinformation kan offras och volymskanning kan uppnås i en lateral skanning genom att utöka fokusdjupet, det vill säga volyminformationen projiceras på en enda 2D-bild, kan bildhastigheten förbättras avsevärt. Detta kallas EDF-avbildning (Extended Depth of Focus), vilket är särskilt användbart för att avbilda glesa befolkningsstrukturer som kräver hög tidsupplösning, t.ex.
som funktionell avbildning av neuronal aktivitet.
De axiella och laterala upplösningarna för ett mikroskop bestäms av den numeriska bländaren (NA) hos objektivlinsen. Hög NA kan maximera axiell och lateral upplösning såväl som mängden ljus som samlas in; Lägre NA kommer att resultera i lägre axiell upplösning, dvs längre fokusdjup, men samtidigt offra sidoupplösning och ljusuppsamlingseffektivitet. Metoden för att utöka fokusdjupet som kommer att introduceras härnäst kan uppnå detta samtidigt som hög lateral upplösning och tillräckligt ljusflöde bibehålls.
Användningen av rumsliga ljusmodulatorer för att generera fokala smala Bessel-strålar kan uppnå EDF-avbildning, men rumsliga ljusmodulatorer är skrymmande och svåra att vara kompatibla med smala mikroskoputrymmen; Däremot är Bessel-moduler baserade på axiella pyramider billiga och kompakta, men de kan bara generera brännpunkter med fast djup och är inte lämpliga för olika experiment som kräver kontinuerliga förändringar i bränndjupet. För att ta itu med denna fråga, under 2018, RONGWEN LU et al. demonstrerade en Bessel-modul baserad på ett axicon, där endast en lins behöver översättas längs den optiska axeln för att kontinuerligt justera den axiella längden på Bessel-brännpunkten.
