Multifotonmikroskopi avbildningsteknik: polarisations-upplöst andra-övertonsgenerationsmikroskopi och dess bildbehandling
I olinjära optiska mikroskop används vanligen andra harmonisk generation (SHG) avbildning för att observera endogena fibrösa strukturer, och intensiteten av SHG beror till stor del på den relativa vinkeln mellan polarisationsriktningen för den infallande strålen och målmolekylens orienteringsaxel. Därför kan polarisationsbaserad SHG-avbildning (P-SHG) erhålla strukturell information om målmolekyler genom att analysera det funktionella förhållandet mellan SHG-signalintensiteten och polarisationstillståndet för den infallande strålen. Det används nu som ett viktigt verktyg för medicinsk och biologisk analys.
Enkla SHG-bilder kan erhållas genom traditionell två-fotonexcitationsfluorescensmikroskopi (TPM). De flesta TPM-system använder fortfarande en enkelstråleskanningsmetod baserad på en rörlig spegel, vars tidsupplösning beror på spegelns fysiska rörelsehastighet. För att uppnå snabbare bildåtergivning kan TPM-systemet också använda en multistråleskanningsmetod (Figur 1A), varav en är att använda en roterande skivavsökningsenhet. Den här enheten består av en koaxial skivspelare med mikrolins och en skivspelare med pinhole, med mikrolinserna och pinhålen på varje skivspelare som motsvarar en-till-ett.
När lasern passerar genom mikrolinsskivan täcker vågfronten flera mikrolinser. Olika mikrolinser fokuserar olika delar av vågfronten till olika positioner och passerar genom motsvarande nålhål och bildar flera mikrostrålar. Dessa mikrostrålar som träffar provet kan excitera flera signaler samtidigt. Dessa signaler återvänder längs mikroskopsystemet och passerar genom hålet igen och reflekteras slutligen av den dikroiska spegeln mellan de två skivspelarna in i detektionsanordningen. Den vanliga låsta titansafirlasern som ljuskälla har dock otillräcklig energi, vilket begränsar antalet excitationsstrålar och resulterar i ett litet effektivt synfält (FOV) för TPM (TPM-SD) med en roterande skanningsenhet.
Ai Goto et al. syftade till att uppnå P-SHG-avbildning med hög-hastighet med ett stort synfält (FOV) med hjälp av TPM-SD-systemet. Därför introducerades en Yb-baserad laserkälla med högre toppeffekt i TPM-SD-systemet.
Det här är ett schematiskt diagram över TPM-SD-systemet som de utvecklade. Systemets ljuskälla är en Yb-baserad laser, som genererar femtosekundpulser med en centrumvåglängd på 1042 nm, en medeleffekt på 4 W, en pulsbredd på 300 fs och en repetitionshastighet på 10 MHz. Systemet justerar först lasereffekten genom en halvvågsplatta och en Glan-laserpolarisator, och expanderar sedan strålen genom en strålexpanderare. Den expanderade strålen införs i skivspelarens avsökningsenhet, och flera mikrostrålar som kommer ut ur avsökningsenheten fokuseras på flera punkter i provet genom en vattensänkningsobjektiv. För att justera polarisationstillståndet för ljusstrålen vid objektivlinsen placeras en halvvågsplatta och en kvartsvågsplatta på exciteringsstrålens optiska väg.
