Principer och strukturella egenskaper hos fluorescensmikroskop
Fluorescensljuskällan använder i allmänhet en ultrahögtryckskvicksilverlampa (50–200 W), som avger ljus med olika våglängder. Varje fluorescerande ämne har emellertid en specifik excitationsvåglängd som genererar intensiv fluorescens. Av denna anledning krävs ett excitationsfilter (vanligtvis tillgängligt i ultravioletta, violett, blå och gröna typer) för att endast tillåta excitationsljus med en specifik våglängd att passera genom och bestråla provet, samtidigt som det absorberar alla andra våglängder.
När det bestrålas med excitationsljus avger varje ämne synlig fluorescens med en längre våglängd än excitationsljuset inom en extremt kort tid. Fluorescens är mycket specifik och generellt svagare än excitationsljuset. För att observera denna specifika fluorescens måste ett barriärfilter (eller undertryckande) installeras bakom objektivlinsen. Det tjänar två syften: för det första absorberar och blockerar det excitationsljus från att komma in i okularet för att undvika att störa fluorescensobservation och skada ögonen; för det andra överför den selektivt specifik fluorescens för att producera en distinkt fluorescerande färg. De två typerna av filter måste väljas och användas i matchande par.
Fluorescensmikroskop är indelade i två typer baserat på deras optiska väg:
1. Transmitterat ljus fluorescensmikroskop
I denna design passerar excitationsljuskällan genom kondensorn och provmaterialet för att excitera fluorescens. En mörkfältskondensor används vanligtvis, även om en standardkondensor också kan användas; den reflekterande spegeln är justerad för att omdirigera och sidobestråla excitationsljuset på provet. Detta är en relativt äldre typ av fluorescensmikroskop. Dess fördel är stark fluorescens vid låg förstoring, medan dess nackdel är att fluorescensintensiteten minskar när förstoringen ökar. Den är därför bättre lämpad för att observera större provmaterial.
2. Epifluorescensmikroskop
Detta är en modern, nyutvecklad typ av fluorescensmikroskop. Till skillnad från designen med genomsläppt ljus projiceras excitationsljus nedåt genom objektivlinsen på provets yta - samma objektivlins fungerar både som belysningskondensor och det fluorescenssamlande objektivet. En dikroisk stråldelare är installerad i den optiska banan i en 45 graders vinkel mot den optiska axeln. Excitationsljus reflekteras in i objektivlinsen och fokuseras på provet. Fluorescensen som genereras av provet, tillsammans med excitationsljus som reflekteras från ytorna på objektivlinsen och täckglaset, går samtidigt in i objektivlinsen och återgår till den dikroiska stråldelaren, som separerar excitationsljus från fluorescens. Kvarvarande excitationsljus absorberas sedan av barriärfiltret.
Genom att byta filterblock med olika kombinationer av excitationsfilter, dikroisk stråldelare och barriärfilter kan kraven på olika fluorescerande reaktionsprodukter uppfyllas. Fördelarna med denna typ av fluorescensmikroskop inkluderar enhetlig fältbelysning, skarp avbildning och ökande fluorescensintensitet vid högre förstoringar.
