Principer för fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskop skiljer sig från vanliga optiska mikroskop. Istället för att observera prover under belysning av vanliga ljuskällor använder de ljus av en viss våglängd (vanligtvis ultraviolett ljus, blåviolett ljus) för att excitera de fluorescerande ämnena i proverna under mikroskopet för att få dem att avge fluorescens. Ljuskällan i ett fluorescensmikroskop fungerar därför inte som direkt belysning, utan som en energikälla som exciterar de fluorescerande ämnena i provet. Anledningen till att vi kan observera provet beror på belysningen av ljuskällan, men fluorescensfenomenet som presenteras efter att det fluorescerande ämnet i provet absorberar den exciterade ljusenergin.
Det kan ses att kännetecknet för fluorescensmikroskopet är att dess ljuskälla kan tillföra en stor mängd excitationsljus i ett specifikt våglängdsområde, så att det fluorescerande ämnet i det testade provet kan erhålla excitationsljuset med den nödvändiga intensiteten. Samtidigt måste fluorescensmikroskopet ha motsvarande filtersystem.
Fluorescensmikroskopi är ett viktigt verktyg i immunfluorescenshistokemi. Den består av ultrahögspänningsljuskälla, filtersystem (inklusive excitations- och undertryckningsfilterplatta), optiskt system och fotografisystem och andra huvudkomponenter. Den använder ljus av en viss våglängd för att excitera provet för att avge fluorescens.
Sättet att excitera fluorescens: Enligt ljusets våglängdsområde kan det delas in i två typer: UV-exciteringsmetod (med ultraviolett belysningsmetod) och BV-excitationsmetod (med blåviolett ljus). UV-exciteringsmetoden använder nära-ultraviolett ljus kortare än 400nm för excitation. Det finns inget synligt excitationsljus i denna metod, så den observerade fluorescensen presenterar färgämnets inneboende fluorescens, och det är lätt att skilja den specifika fluorescensen på provet från autofluorescensen i bakgrundsvävnaden.
BV-excitationsmetoden är baserad på 404nm och 434nm för excitation från ultraviolett till blått ljus. Denna metod använder blått ljus för att bestråla provet, så cut-off-filtret i fluorescensobservationssystemet måste använda ett filter som helt kan blockera det blå ljuset och helt klara den gröna och gula fluorescensen. Fluorescerande färgämnen för fluorescerande antikroppsanalyser. Den maximala absorptionsvåglängden för excitationsljus är relativt nära den maximala emissionsvåglängden för fluorescens, så filtret som används i BV-excitationsmetoden måste använda ett skarpt avskärningsfilter. Denna metod kan använda blått ljus som excitationsljus, så absorptionseffektiviteten för det fluorescerande pigmentet är högre och en ljusare bild kan erhållas. Dess nackdel är att fluorescensen under 500nm inte kan ses, och fluorescensen över 500nm gör att hela bilden ser gul ut. I metoden med fluorescerande antikroppar bedöms fluorokromens specificitet ofta av den unika färgen för fluorokromen. Därför, när man diskuterar subtil specificitet, har de ovan nämnda bristerna med BV-excitationsmetoden ofta ett stort inflytande.
Sammanfattningsvis kan belysningen av fluorescensmikroskopet övervägas enligt följande tre punkter enligt kondensorns struktur och excitationsljusets våglängd.
① Ur perspektivet av kontrastkraven för den fluorescerande bilden, används UV-excitationsmörkfältskoncentratorn för belysning.
② Med tanke på bildens ljusstyrka har BV-excitationsfiltret den högsta observationseffektiviteten för mörka fält.
③Karakteristiken för observation av mörkfältsobservation med UV-excitationsfilter och BV-excitationsbelysning i mörkfältskoncentrator kan betraktas som mellan dessa två belysningsmetoder, men den förra har starkare mörkfältsegenskaper och visar ljusare bilder. Kontrasten är liten; den senare behåller egenskaperna för mörkfältets ljusbana, så den visade bilden är mörkare och kontrasten förbättras. När man faktiskt använder ett fluorescensmikroskop bör den belysningsmetod som bäst passar provets krav användas för observation.
Det måste påpekas att även om den UV-exciterade mörkfältskondensorn med den bästa kontrasten är belyst, kommer en del av det ultravioletta excitationsljuset som bryts eller sprids av provet att komma in i objektivlinsen. Autofluorescens kan förvärra bildresponsen. Därför måste ett UV-absorberande filter användas framför okularet som avskärningsfilter.
