Principer för laserkonfokalmikroskopi (LSCM)
Ett konfokalt lasermikroskop använder ett belysningsnålshål placerat bakom ljuskällan och ett detekteringsnålhål placerat framför detektorn för att uppnå punktbelysning och punktdetektering. Ljus från ljuskällan fokuseras på en punkt i provets fokalplan av ljus som emitteras genom belysningshålet, och fluorescens som emitteras från den punkten avbildas i detektionsnålhålet, och allt emitterat ljus utanför den punkten blockeras av upptäckt pinhole. Belysningsnålhålet och detektionsnålhålet är konjugerade för den upplysta eller detekterade punkten, så att den detekterade punkten är konfokalpunkten och planet där den detekterade punkten är belägen är det konfokala planet. Datorn visar den upptäckta punkten på datorskärmen i form av en bildpunkt. För att producera en komplett bild skannar ett skanningssystem i den optiska banan över provets fokalplan och producerar på så sätt en komplett konfokal bild. Så länge som bärarsteget flyttas upp och ned längs Z-axeln, flyttas en ny nivå av provet till det konfokala planet, och den nya nivån av provet avbildas på monitorn, allt eftersom Z-axeln fortsätter att flytta, erhålls successiva ljusskurna bilder av olika nivåer av provet.
Det traditionella optiska mikroskopet använder en fältljuskälla, bilden av varje punkt på provet kommer att störas av diffraktionen eller spridningen av ljus från de angränsande punkterna; laserskanning konfokalmikroskop använder en laserstråle genom det upplysta nålhålet för att bilda en punktljuskälla på provet som skannas vid varje punkt av det inre fokalplanet, provet på den bestrålade punkten, avbildningen av detektionsnålhålet, genom detektering av nålhålet efter ljuspunktsmultiplikationsröret (PMT) eller kallelektrokopplad enhet (cCCD) Mottagen punkt för punkt eller rad för rad bildas snabbt en fluorescerande bild på datorskärmen. Belysningsnålhålet och detektionsnålshålet i förhållande till objektivlinsens fokalplan är konjugerat, punkten på fokalplanet samtidigt fokuserad på belysningsnålhålet och emissionsnålhålet, punkten utanför fokalplanet kommer inte att vara i detekteringen av nålhål vid avbildningen, så att den erhållna konfokala bilden är provets optiska tvärsnitt, vilket övervinner bristerna hos den vanliga mikroskopbilden som är luddig.
Från grundprincipen är laserkonfokalmikroskop ett modernt optiskt mikroskop, det är det vanliga ljusmikroskopet från tekniken för att göra följande förbättringar.
1. Använd laser som ljuskälla eftersom laserns monokromaticitet är mycket bra, ljuskällans våglängd är densamma, vilket i grunden eliminerar den kromatiska aberrationen.
2. Användningen av konfokalteknik i fokusplanet för objektivlinsen placerad i mitten med ett litet hål i baffeln, brännvidden utanför ströljuset blockerar, vilket eliminerar den sfäriska aberrationen; och ytterligare eliminera den kromatiska aberrationen.
3. Konfokalt lasermikroskop som använder punktskanningsteknik för att sönderdela provet i tvådimensionellt eller tredimensionellt utrymme till otaliga punkter, med en mycket liten laserstråle (punktljuskälla) punkt för punkt, linje för linje skanningsavbildning, och sedan genom mikrodatorkombinationen av ett helt plan eller tredimensionell bild. Det traditionella ljusmikroskopet är en fältljuskälla under engångsavbildningen, prover på varje punkt i bilden kommer att ligga intill punkten för diffrakterat ljus och spritt ljusinterferens. Tydligheten och precisionen i dessa två bilder går inte att jämföra.
4. Insamling och bearbetning av optiska signaler med en dator och förstärkning av signalerna med ett fotomultiplikatorrör
I det konfokala lasermikroskopet ersätter datorn det mänskliga ögat eller kameran för observation och videoinspelning, och bilderna som erhålls digitaliseras och kan bearbetas i datorn för att förbättra bildernas klarhet igen. Dessutom kan användningen av fotomultiplikatorrör förstärka mycket svaga signaler, vilket avsevärt förbättrar känsligheten. Som ett resultat av den kombinerade användningen av ovanstående teknologier kan man säga att LSCM är det mest avancerade mikroskopet i världen. Man kan säga att LSCM är kombinationen av mikroskopproduktionsteknik, fotoelektrisk teknik, datorteknik **, är den oundvikliga produkten av utvecklingen av modern teknik.
