Standardprocedur för kalibrering av polarisatorer i ett polariserande mikroskop
Fluorescensmikroskop skiljer sig från vanligt optiskt mikroskop genom att det inte observerar prover under belysning av vanliga ljuskällor. Istället använder den en viss våglängd av ljus (vanligtvis ultraviolett ljus, blåviolett ljus) för att excitera de fluorescerande ämnena inuti provet under mikroskopet, vilket får dem att avge fluorescens. Därför är ljuskällans roll i fluorescensmikroskop inte direkt belysning, utan som en energikälla för att excitera de fluorescerande ämnena inuti provet. Anledningen till att vi kan observera prover beror inte på belysningen av ljuskällan, utan det fluorescensfenomen som uppvisas av de fluorescerande ämnena inuti provet efter att ha absorberat den exciterade ljusenergin. Av detta kan man se att kännetecknet för fluorescensmikroskopi huvudsakligen är att dess ljuskälla kan leverera en stor mängd excitationsljus i ett specifikt våglängdsområde, så att de fluorescerande ämnena i provet kan erhålla den nödvändiga intensiteten av excitationsljus. Samtidigt måste fluorescensmikroskop ha motsvarande filtersystem. Fluorescensmikroskop är ett grundläggande verktyg inom fluorescensvävnadskemi. Den består av huvudkomponenter som en ultra-högspänningsljuskälla, ett filtersystem (inklusive excitations- och undertryckningsfilterplattor), ett optiskt system och ett fotografisystem. Den använder ljus av en viss våglängd för att excitera provet och avge fluorescens.
1. Metoder för fluorescensexcitering: Enligt ljusets våglängdsområde finns det två typer: UV-exciteringsmetod (med ultraviolett belysning) och BV-exciteringsmetod (med blåviolett ljus). UV-exciteringsmetoden använder nära ultraviolett ljus kortare än 400nm för excitation. Denna metod har inte synligt excitationsljus, så den observerade fluorescensen uppvisar färgämnets inneboende fluorescens, vilket gör det lätt att skilja den specifika fluorescensen på provet från självfluorescensen i bakgrundsvävnaden.
2. BV-exciteringsmetod: Den involverar excitation från ultraviolett till blått ljus centrerat vid 404nm och 434nm. Denna metod använder blått ljus för att bestråla provet, så det avskurna filtret i fluorescensobservationssystemet måste använda ett filter som helt kan blockera blått ljus och helt passera genom den gröna och gula fluorescensen som krävs. Fluorescerande pigment som används för fluorescerande antikroppsmetod. Den maximala absorptionsvåglängden för excitationsljus och den maximala emissionsvåglängden för fluorescens är relativt nära, så filtret som används i BV-excitationsmetoden måste använda ett skarpt skärfilter. Denna metod kan använda blått ljus som excitationsljus, så absorptionseffektiviteten för fluorescerande pigment är hög och ljusare bilder kan erhållas. Nackdelen är att fluorescens under 500nm inte kan ses, medan fluorescens över 500nm gör att hela bilden ser gul ut. I metoden med fluorescerande antikroppar bestäms specificiteten mestadels av färgen som är unik för fluorescerande pigment, så när man diskuterar subtil specificitet har nackdelarna med BV-excitationsmetoden som nämns ovan ofta en betydande inverkan.
