Tekniska egenskaper och användningsförmåga hos tvåfotonfluorescensmikroskop
Tvåfotonfluorescensmikroskopi är en ny teknik som kombinerar laserskanningskonfokalmikroskopi och tvåfotonexcitationsteknik.
Grundprincipen för tvåfotonexcitation är: vid hög fotondensitet kan fluorescerande molekyler absorbera två långvågiga fotoner samtidigt och emittera en foton med kortare våglängd efter en kort period av så kallat exciterat tillståndslivslängd . ; Effekten är densamma som att använda en foton med en våglängd som är hälften av den långa våglängden för att excitera en fluorescerande molekyl. Två-fotonexcitation kräver en hög fotondensitet. För att inte skada celler använder tvåfotonmikroskopi högenergilägeslåsta pulsade lasrar. Lasern som emitteras av denna laser har hög toppenergi och låg medelenergi, dess pulsbredd är bara 100 femtosekunder och dess period kan nå 80 till 100 megahertz. När man använder en objektivlins med hög numerisk bländare för att fokusera fotonerna i den pulsade lasern, är fotondensiteten vid objektivlinsens brännpunkt högst, och exciteringen av två foton sker endast vid objektivlinsens brännpunkt, så tvåfotonmikroskopet behöver inte ett konfokalt nålhål, vilket förbättrar effektiviteten för fluorescensdetektion. Det är en viktig forskningsmetod inom områdena morfologi, molekylär cellbiologi, neurovetenskap och farmakologi.
1. Bakgrunden till uppkomsten av tvåfotonmikroskopi - två begränsningar för traditionell laserkonfokalmikroskopi:
1) Ett är fototoxicitetsfenomenet: eftersom det konfokala nålhålet måste vara tillräckligt litet för att få en högupplöst bild, och den lilla bländaren kommer att blockera en stor del av fluorescensen som emitteras från provet, inklusive fluorescensen som emitteras från fokalplanet, motsvarande Ja, excitationsljuset måste vara tillräckligt starkt för att erhålla ett tillräckligt signal-brusförhållande; och den högintensiva lasern kommer att få det fluorescerande färgämnet att blekna snabbt under kontinuerlig skanning, och den fluorescerande signalen kommer att bli svagare och svagare när skanningen fortskrider.
2) Fototoxicitet är ett annat problem. Under laserbestrålning kommer många fluorescerande färgämnesmolekyler att producera cytotoxiner som singletsyre eller fria radikaler, så skanningstiden och den optiska effekttätheten för excitationsljuset bör begränsas i experimentet för att bibehålla provdensiteten. aktiva. I forskningen om aktiva prover, särskilt de olika stadierna av tillväxt och utveckling av aktiva prover, gör fotoblekning och fototoxicitet dessa studier mycket begränsade.
2. Varför säger du att tvåfotonmikroskop i allmänhet inte behöver vara utrustade med ultravioletta excitationslasrar?
Tvåfotonmikroskopi är en fluorescensexcitationsteknik baserad på tvåfotonexcitationseffekten: fluorescerande färgämnesmolekyler kan exciteras genom att absorbera två lågenergifotoner samtidigt (tidsintervallet mellan två fotoner som når fluorescerande molekyler är mindre än 1 femtosekund ), kan dess excitationseffekt motsvara att absorbera en högenergifoton med 1/2 våglängd. Till exempel, att absorbera två fotoner vid röda våglängder är ekvivalent med en molekyl som absorberar ultraviolett ljus. Långvågiga fotoner absorberas inte lätt av celler, så fototoxicitet för levande celler minskar och fotoblekning minskar också. På detta sätt spelar den inte bara funktionen av ultraviolett excitation, utan undviker också skadan av ultraviolett ljus på provet.
3. Vad är speciellt med lasern i tvåfotonmikroskop?
Sannolikheten för tvåfotonabsorption beror på hur nära de två infallande fotonerna sammanfaller i rum och tid (de två fotonerna måste anlända inom 10-18 sekunder). Tvåfotonabsorptionstvärsnittet är litet, och endast fluoroforer i områden med ett stort fotonflöde exciteras. Därför är de flesta lasrar som används titan safir lasrar, som kan uppnå pikosekund eller femtosekund skanningshastigheter, och har mycket hög toppeffekt och låg medeleffekt, så att fotoblekning och fototoxicitet kan reduceras eller elimineras. Det viktigaste är att tillhandahålla en mycket hög densitet av fotoner i ett litet område, vilket kan säkerställa samtidig excitation av två fotoner.
4. Vilka är fördelarna med två-foton excitation?
1) Öka färgämnets selektivitet: excitationsljusområdet för det konfokala systemets laser (Ar, Ar/Kr, HeNe) är 488nm - 647nm. Detta innebär att experimentera med UV-exciterade fluorescerande färgämnen, t.ex. med DAPI , Hoescht. Excitationsvåglängden för två-foton är dubbelt så stor som för en-foton, så färgämnen som exciteras av ultraviolett ljus kan exciteras av nära-infrarött ljus.
2) Minska fotoblekning: På grund av minskningen av fotoblekning ökar framgångsfrekvensen för experiment med CFP/YFP för fluorescensresonansenergiöverföring (FRET).
3) Ingen speciell objektivlins krävs: Ur hårdvarusynpunkt kräver exciteringen av UV-exciterade färgämnen med våglängden av nära-infrarött ljus inga speciella UV-optiska komponenter.
4) Förbättra signal-brusförhållandet: excitationsljusvåglängden och det emitterade ljusets våglängd har en stor skillnad, vilket förbättrar signal-brusförhållandet.
5) Blekning lokaliserad till brännpunkten: Eftersom fluorescensexcitation endast sker vid objektivets brännpunkt, finns det inget behov av ett konfokalt nålhål. Detta förbättrar ljusdetektion och fotoblekning sker endast vid brännpunkten.
6) Lättare att penetrera prover: Infrarött våglängdsljus sprids inte lätt av celler och kan penetrera djupare prover.
5. Jämfört med laserskanningskonfokalmikroskopi, vilken är den största förbättringen som gjorts av tvåfotonmikroskopi?
1) Minskad fotoblekning.
2) Minskad fototoxicitet.
3) Det är inte lätt att sprida, och det är lättare att penetrera tjocka prover, såsom hjärnskivor.
