Laserkonfokalmikroskopi - Funktioner och tillämpningar
Laser scanning confocal microscopy (LSCM) är en typ av mikroskop designad baserat på konjugerad fokusteknologi, det vill säga laserljuskällan, provet som ska mätas och detektorn är alla i konjugerade positioner med varandra.
Grundläggande
I ett allmänt mikroskop isoleras observationsplanet från det intilliggande axiella planet genom att fokalplanet för objektivlinsen sammanfaller med detektorn, medan i ett konfokalmikroskop används en diffraktionsbegränsad ljuspunkt för att belysa provet och A pinhole används i den insamlade ljusbanan vid ljuspunktens konjugerade fokus för att filtrera ströljus för att skapa denna isoleringseffekt och därigenom förbättra upplösningen.
Bildfunktioner
Optisk sektionsskanning avbildning
En annan egenskap hos laserskanningskonfokalmikroskopi är att det är en skanningsteknik. Den traditionella bredfältsbelysningstekniken belyser hela provet, så att bilden kan fångas direkt med blotta ögat eller en detektor, men LSCM använder en stråle eller Flera fokuserade strålar passerar genom provet för att skanna och avbilda. Den resulterande bilden kallas en optisk sektion. Följande visar skillnaden mellan den traditionella bredfältsbelysningsmetoden och laserskanningsmetoden för konfokal belysning.
Därför är en faktisk arbetsmetod för ett modernt konfokalmikroskop som visas i figuren nedan. Excitationsljuset som emitteras av lasern passerar genom en dikroisk spegel och skannas i provets x-riktning och y-riktning genom ett par galvanometrar. Excitationen (eller reflektionen) av provet är Ljus kommer in i PMT-detektorn genom hålet och registreras, och den inspelade skannade bilden rekonstrueras av en dator för att rekonstruera den faktiska provbilden.
Generera "z-stack" bilder på olika fokalplan
Endast ljuset som reflekteras tillbaka från det konjugerade provlagret kan passera genom det lilla hålet i uppsamlingsljusbanan, och de återstående irrelevanta provlagerreflektionerna blockeras av det lilla hålet. Detta kan resultera i betydande upplösningsförbättringar. Jämförelse sida vid sida av multidimensionell fluorescensmikroskopi och konfokalmikroskopi av samma tjocka prov. När en serie bilder tas i olika fokalplan kan bilder som vanligtvis kallas "z-stackar" genereras, som illustrerar upplösningen och kontrastförstärkningarna som erbjuds av konfokalmikroskopi och de bakomliggande orsakerna till dessa vinster. Det kan ses att en undersökning av bilden överst i stapeln med avbildningsplanet ovanför vävnaden avslöjar en stor mängd spritt ljus i fluorescensbilden, medan den konfokala mikroskopibilden ser svart ut. Denna minskning av axiell PSF resulterar direkt i upplösningsskillnaden som observeras vid det optiska gränssnittet i mitten av z-stacken.
Upplösningen är avsevärt förbättrad jämfört med bredfältsbelysning
I fluorescensmikroskopi beskrivs ljusintensiteten som emitteras från en enda punkt av punktspridningsfunktionen (PSF), och dess mönster är en luftig skiva. Upplösningen av fluorescenssystemet kan beskrivas av radien på Airy-skivan, som kan beskrivas av Objektivlinsens numeriska bländare och excitationsljusets våglängd bestämmer
